宿主系统发育、食性与栖息地如何影响野生蛇类肠道微生物多样性

《Ecology and Evolution》：How Host Phylogeny, Diet, and Habitat Affect Gut Microbial Diversity in Wild Snakes

　　

肠道微生物在宿主消化、免疫调节、神经化学信号传导和代谢稳态中发挥着关键作用。基于来自中国的野生蛇类（23个物种的73个个体）粪便宏基因组样本，研究人员探索了不同类群肠道微生物的组成、特征和功能；进一步探究了宿主系统发育、食性和栖息地对微生物结构的相对贡献。在23个野生蛇种中，优势肠道微生物门为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria），主要属包括拟杆菌属（Bacteroides）、沙门氏菌属（Salmonella）、柠檬酸杆菌属（Citrobacter）和气单胞菌属（Aeromonas）。Mantel检验揭示了属水平微生物组成与宿主遗传分歧（p-距离）之间存在显著相关性（r = 0.3173, p = 0.0055），表明系统发育对肠道微生物谱存在潜在影响。然而，α-多样性分析和主坐标分析（PCoA）显示不同亚组间没有显著差异。线性判别分析效应量（LEfSe）表明，不同食性的陆栖蛇类以及不同栖息地的脊椎动物捕食蛇类，其肠道微生物存在显著差异。微生物基因的功能注释表明其在代谢过程以及环境和遗传信息处理方面富集。碳水化合物活性酶（CAZymes）主要来自GT2、GT4、GT51和GH23家族。LEfSe分析显示不同食性和栖息地具有不同的差异类群。此外，抗生素抗性基因（ARGs）谱在不同组间存在差异，其中acrB、AcrF、MexB、acrD和mdtF最为普遍。未来的研究应增加样本量，并综合考虑不同的生态因素，以探索其对不同进化路径上蛇类肠道微生物组成和功能的影响，这将为深入理解蛇类肠道微生物与其宿主之间的相互关系提供帮助。

**野生蛇类肠道微生物多样性：系统发育、食性与栖息地的综合影响解读**

**研究背景、问题与意义**
肠道微生物组是脊椎动物肠道内一个动态复杂的系统，通过多种机制影响宿主生理，包括促进消化和营养吸收、合成必需生物活性化合物以及调节神经行为过程。越来越多的证据表明，肠道微生物群落的形成受到宿主系统发育历史、饮食组成和栖息地特征之间复杂相互作用的塑造。其中，“系统共生”概念描述了宿主谱系与其相关微生物组之间的进化一致性，即系统发育上更接近的物种往往表现出更大的微生物相似性。然而，在牛科物种等案例中，微生物组成似乎更多地受饮食输入而非系统发育亲缘关系的影响，这表明在更精细的分类尺度上，生态因素可能超越进化信号。对于爬行动物，特别是蛇类，其作为变温动物，具有简化的肠道结构和显著的种间食性与栖息地差异，其肠道微生物的驱动因素及其功能特征尚不清晰。目前，关于野生蛇类肠道微生物多样性如何受宿主系统发育、食性和栖息地共同影响的研究仍较为缺乏，尤其是在宏基因组水平上进行全面功能剖析的研究。因此，开展此项研究对于理解蛇类宿主-微生物互作、生态适应以及潜在的人畜共患病风险具有重要意义。本论文发表于《Ecology and Evolution》期刊。

**主要技术方法概述**
研究人员于2021年7月至2023年9月期间，在中国各地采集了代表23个物种、17个属、9个科的73条成年健康野生蛇的粪便样本。根据已发表资料，将样本划分为两个食性组（无脊椎动物捕食者和脊椎动物捕食者）和四种栖息地类型（树栖、穴居、半水栖和陆栖）。样本经液氮速冻后于-80°C保存。使用商品化试剂盒提取粪便基因组DNA，并送往北京诺禾致源公司进行宏基因组下一代测序（mNGS）文库构建，在Illumina HiSeq 2500/MiSeq平台上进行PE150测序。对原始数据进行质量控制和宿主序列过滤后，使用Kraken2进行物种注释，使用Megahit进行序列组装，并使用KofamScan、CAZy数据库和CARD（Comprehensive Antibiotic Resistance Database）数据库分别进行KEGG功能、碳水化合物活性酶（CAZymes）和抗生素抗性基因（ARGs）的注释。利用基于线粒体基因（COI、CYTB、ND2、ND4）构建的宿主系统发育树，通过Mantel检验、主坐标分析（PCoA）、置换多元方差分析（PERMANOVA）和线性判别分析效应量（LEfSe）等方法，分析微生物组成与宿主系统发育、食性及栖息地的关系。

**研究结果**
**3.1 测序数据质量评估**
对73个样本的测序产生了大量高质量序列，各食性组和栖息地组的Q20、Q30、GC含量和数据有效率均表现优异，表明测序数据质量高，足以支持后续分析。

**3.2 野生蛇类肠道微生物的组成与特征**
基于宏基因组测序，23种野生蛇的肠道微生物主要由细菌（93.79%）构成。共鉴定出20,341个细菌物种，归属于49个门、82个纲、187个目、439个科和2428个属。优势菌门（相对丰度≥3%）为变形菌门（61.83% ± 22.31%）、拟杆菌门（22.63% ± 20.46%）、厚壁菌门（7.77% ± 5.07%）和放线菌门（3.92% ± 3.21%）。优势菌属（相对丰度≥4%）为拟杆菌属（17.69% ± 20.91%）、沙门氏菌属（7.50% ± 10.01%）、柠檬酸杆菌属（5.05% ± 5.67%）和气单胞菌属（4.81% ± 9.35%）。这些优势类群在两个食性组和四种栖息地类型中均被观察到。

**3.3 野生蛇类亚组间肠道微生物差异**
Mantel检验结果显示，在门水平上，肠道微生物与宿主系统发育无显著相关性；在属水平上，则观察到显著相关性（r = 0.3173, p = 0.0055）。α-多样性分析显示四个蛇类亚组（I–IV）间无显著差异。主坐标分析（PCoA）的R²值普遍较低（0.07–0.37）且所有p值 > 0.05，表明宿主系统发育、食性和栖息地对肠道微生物结构没有显著的总体影响。然而，LEfSe分析揭示了食性和栖息地亚组间微生物丰度的显著差异。在亚组I（不同食性）中，无脊椎动物捕食物种富集了12个差异微生物类群（主要来自放线菌门、厚壁菌门、变形菌门和浮霉菌门），而脊椎动物捕食物种富集了4个来自厚壁菌门的类群。在亚组II（半水栖与陆栖脊椎动物捕食者）中，半水栖物种拥有6个独特的微生物类群，陆栖物种拥有1个，均属于变形菌门下的β-变形菌纲和γ-变形菌纲。

**3.4 野生蛇类肠道微生物功能预测**
基于肠道微生物基因的功能注释，最丰富的10项预测功能主要与代谢活动以及环境和遗传信息处理相关。无脊椎动物捕食蛇类的主要功能包括编码“triadin”基因，但不包括编码“二肽转运系统ATP结合蛋白”的基因。穴居蛇类的主要功能包括编码“trimerin”基因和“DALR反密码子结合域包含蛋白3”，但不包括“二肽转运系统ATP结合蛋白”和“MFS转运蛋白，DHA1家族，多药耐药蛋白”。
野生蛇类肠道微生物中最丰富的四个CAZymes家族是GT2（10.19% ± 1.76%）、GT4（6.84% ± 1.69%）、GT51（3.57% ± 0.90%）和GH23（3.49% ± 1.07%），该组成在食性和栖息地组间保持一致。但LEfSe分析显示组间CAZymes谱存在差异：无脊椎动物捕食蛇类表现出19个独特的差异CAZymes家族（GH:GT:CBM:AA:CE = 8:7:2:1:1），而脊椎动物捕食蛇类表现出18个（GH:GT:CBM:CE:PL = 12:1:3:1:1）。在栖息地组中，树栖和半水栖物种各显示出三个独特的差异类群。
抗生素抗性基因（ARGs）分析显示，最丰富的五种是acrB、AcrF、MexB、acrD和mdtF。这些抗性基因的相对丰度在脊椎动物捕食蛇类中高于无脊椎动物捕食蛇类。在不同栖息地组中，ARGs丰度顺序为：陆栖 > 树栖 > 穴居（rsmA除外）> 半水栖。

**讨论与结论总结**
**讨论部分要点：**
本研究首次利用宏基因组测序探索了蛇类肠道微生物多样性。结果表明，变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门是优势菌门，这与部分先前研究一致，但也存在差异，可能反映了不同宿主肠道内独特的生化适应。优势菌属包括拟杆菌属、沙门氏菌属、柠檬酸杆菌属和气单胞菌属，这些属包含已知的致病菌株，对宿主生理和疾病易感性具有潜在影响。
关于影响因素，在属水平上观察到的宿主系统发育（p-距离）与肠道微生物组成之间的显著相关性，可能与“系统共生”模式一致。但PCoA分析表明，在总体水平上，肠道微生物并未受到宿主系统发育的显著影响，这可能受样本量影响。PCoA结果还表明，食性划分和栖息地在不同分类水平上未产生显著影响。然而，LEfSe分析揭示了食性和栖息地组间微生物丰度的显著差异，这些结果可能与本研究收集的样本量分布不均有关。
在功能方面，肠道微生物的功能主要与代谢活动以及环境和遗传信息处理相关。碳水化合物代谢是主要功能轴，最丰富的CAZymes家族为GT2、GT4、GT51和GH23。LEfSe分析揭示了食性和栖息地组间不同的CAZymes谱，其中食性的影响强于栖息地。脊椎动物捕食蛇类显著富集糖苷水解酶（GH）家族成员，这可能支持其消化适应。肠道微生物组是宿主健康的关键指标，其携带的ARGs为了解宿主抗生素暴露和潜在的人畜共患传播提供了重要信息。本研究中，最丰富的ARGs与细菌对四环素类、β-内酰胺类和喹诺酮类的抗性有关。ARGs丰度在脊椎动物捕食蛇类中更高，且受栖息地调节，表明食性策略和栖息地生态位共同调控ARGs组成。

**研究结论翻译：**
对23种野生蛇类肠道微生物的宏基因组分析共鉴定出20,341个细菌类群（物种），涵盖49个门、82个纲、187个目、439个科和2428个属。优势菌门为变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门，尽管某些物种核心富集了放线菌门或梭杆菌门，这可能受当地环境条件影响。优势菌属为拟杆菌属、沙门氏菌属、柠檬酸杆菌属和气单胞菌属。在属水平上观察到宿主系统发育（p-距离）与肠道微生物组成之间存在显著相关性，这与系统共生模式一致。功能注释表明，参与代谢、环境感知和遗传信息处理的基因富集，功能变异可能与食性分类有关。最普遍的CAZymes家族GT2、GT4、GT51和GH23在食性和栖息地组间保守，但特定酶的差异丰度在组间不同。最丰富的五种ARGs是acrB、AcrF、MexB、acrD和mdtF，其相对丰度受食性和栖息地共同影响。α和β多样性分析表明，系统发育、食性和栖息地并未在不同分类尺度上显著区分蛇类的肠道微生物。未来的研究应增加样本数量，并综合考虑不同的生态因素，以探索其对不同分类群蛇类肠道微生物组成和功能的影响。