综述：天然产物诱导肺癌非凋亡性调控性细胞死亡：聚焦细胞焦亡并兼顾铜死亡与坏死性凋亡的系统综述

《Medicine in Drug Discovery》：Natural products triggering non-apoptotic regulated cell death in lung cancer: A systematic review focusing on pyroptosis, with insights into cuproptosis and necroptosis

　　

肺癌仍是导致癌症死亡的主要原因，凋亡（apoptosis）抵抗限制了常规治疗与靶向治疗的有效性。本系统综述综合了天然产物诱导肺癌非凋亡性调控性细胞死亡的临床前证据，重点聚焦于细胞焦亡（pyroptosis）、铜死亡（cuproptosis）和坏死性凋亡（necroptosis）。研究人员检索了6个数据库，纳入在肺癌模型中评价天然产物、植物化学物质（phytochemicals）、植物提取物或相关生物活性化合物的原始研究。共计25项研究符合纳入标准：18项研究探讨细胞焦亡，5项研究探讨坏死性凋亡，2项研究探讨铜死亡。由于纳入化合物涵盖多种化学类别，且多数原始研究未开展正式的结构-活性关系（structure–activity relationship, SAR）分析，本综述旨在构建机制性证据图谱（mechanistic evidence map），而非骨架优化指南。证据主要来自临床前研究，并集中于非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），尤其是以A549为基础的模型；17项研究还包含异种移植（xenograft）、同种异体移植（allograft）或相关动物实验。在化学结构多样的药物中，天然产物与细胞活力、增殖、迁移、侵袭、集落形成、球体生长、转移及肿瘤生长的降低相关。细胞焦亡最常涉及活性氧（reactive oxygen species, ROS）/核因子κB（NF-κB）/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）/胱天蛋白酶-1（caspase-1）/消皮素D（gasdermin D, GSDMD）信号通路，或caspase-3/消皮素E（gasdermin E, GSDME）活化。铜死亡研究突出铜蓄积、丙酮酸脱氢酶复合物E2组分二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶（dihydrolipoamide S-acetyltransferase, DLAT）相关的线粒体应激、氧化还原失衡和代谢紊乱；而坏死性凋亡研究强调受体相互作用蛋白激酶1/3（receptor-interacting protein kinase 1/3, RIPK1/RIPK3）为核心的信号通路，并涉及ROS、Ca²⁺流、溶酶体损伤、线粒体功能障碍和自噬（autophagy）的贡献。总体而言，天然产物有望成为肺癌非凋亡性细胞死亡的多靶点调节剂，但该领域在临床上仍不成熟，需在标准化的临床前和临床研究中进一步验证。

1 Overall evidence landscape of natural products inducing non-apoptotic cell death in lung cancer

纳入的25项研究均为临床前研究，其中细胞焦亡研究占主导（18项），坏死性凋亡（5项）和铜死亡（2项）研究较少。这一分布反映了焦亡相关检测手段应用较早、较成熟，而铜死亡作为近年才被系统描述的新型死亡方式，相关天然产物研究尚处于起步阶段。研究发表时间总体较新，25项研究中20项发表于2022年之后。

在组织学分布上，绝大多数研究集中于非小细胞肺癌（NSCLC），其中以A549肺腺癌细胞最为常用；仅少量研究涉及小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）、耐药或特定突变背景。17项研究补充了异种移植、同种异体移植或其他动物模型数据，在一定程度上增强了抗肿瘤表型的外推力；然而，这些动物实验仍难以覆盖肺癌在组织亚型、驱动突变、免疫微环境、转移龛和治疗抵抗等方面的异质性。

不同化学类别的天然产物在表型层面呈现一致性抗肿瘤效应，包括降低细胞活力、抑制增殖、迁移、侵袭、集落形成、球体生长及体内肿瘤生长等。需要强调的是，这些表型本身并不等同于特定细胞死亡通路的依赖性活化。为区分必要通路相关标记与伴随性细胞应激，本综述采用四级描述性框架：Level 1为通路相关标记或形态学证据；Level 2为药理学抑制、化学拯救或功能扰动；Level 3为基因敲低/过表达/拯救、直接靶点结合或上游轴验证；Level 4为体内抗肿瘤验证和/或正常细胞对照数据，但单独不作为通路依赖性的证明。通过该框架可见，仅少数研究达到Level 3水平，多数仍为Level 1或Level 2。

2 Mechanistic evidence strength and comparative synthesis

由于纳入研究在模型、检测终点和化合物类别上差异显著，其机制证据强度并不均一。最具说服力的证据来自将死亡表型与执行分子相联系，并通过药理学或遗传学扰动检验通路依赖性的研究，例如通过caspase抑制或GSDME干预削弱焦亡样改变、将上游调控因子与NLRP3/caspase-1/GSDMD信号偶联、通过铜相关拯救或轴验证支持铜死亡，以及通过检测RIPK1/RIPK3复合物或坏死性凋亡靶向干预验证坏死性凋亡。

相比之下，单纯依赖细胞活力下降、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放、ROS蓄积、膜破裂或通路相关蛋白表达变化的研究，只能作为支持性证据。裂解性形态和LDH泄漏可出现在多种细胞损伤形式中，ROS也可作为焦亡、坏死性凋亡、铁死亡（ferroptosis）、凋亡或非特异性应激的共同上游信号。因此，后续综合须以反复出现的通路模式为基础，同时避免将所有化合物归结为单一机制。

3 Molecular pathways through which natural products trigger non-apoptotic cell death in lung cancer

3.1 Pyroptosis

细胞焦亡的数据最为丰富，并呈现两条主要执行路径。第一条是经典的炎症小体/GSDMD通路。多项研究报告了NLRP3活化、caspase-1活化、GSDMD切割、膜孔形成以及IL-1β、IL-18或LDH释放等过程。然而，这些化合物未必共享完全相同的因果序列：部分研究直接评估了ROS/NF-κB/NLRP3信号，另一些研究则主要依赖NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC）、caspase-1、GSDMD、细胞因子、LDH或焦亡形态学变化。因此，该通路应被视为反复出现的模式，而非单一共享机制。

一些研究进一步揭示了更为具体的上游调控。例如，有研究将焦亡与TCONS-14036/miR-1228-5p/PRKCDBP轴联系起来，提示非编码RNA调控可位于炎症小体激活上游；另有研究指出DDX3X/SQSTM1轴可进入NLRP3驱动的焦亡；还有研究显示Smurf2抑制可降低NLRP3泛素化及降解，从而稳定NLRP3；TLR4稳定化可驱动TLR4/NLRP3/caspase-1/GSDMD级联；TGF-β下调可激活MST1、升高ROS并诱导caspase-1/GSDMD焦亡，同时抑制上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。这些上游节点可理解为各自研究进入炎症小体相关执行机制的入口，而非普遍必需步骤。

第二条主要模式是caspase-3/GSDME通路。包括杨梅素（myricetin）、冬虫夏草提取物（Cordyceps militaris extract, CME）、Japoflavone B、硝替卡林氯化物（nitidine chloride）、雷公藤甲素（triptolide）和宝藿苷I（baohuoside I）等化合物均符合该框架，但上游触发事件各异。杨梅素激活Ca²⁺/内质网（endoplasmic reticulum, ER）应激/caspase-12/caspase-3/GSDME信号级联，提示细胞器应激可将肺癌细胞导向GSDME介导的焦亡。CME依赖caspase-3与GSDME，且caspase-3抑制剂可削弱其效应，因果推断较强。Japoflavone B似乎通过多聚ADP核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase 1, PARP1）抑制、DNA损伤、ROS蓄积及p38/p53轴，最终仍导致caspase-3切割GSDME。硝替卡林氯化物将焦亡与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）/蛋白激酶B（Akt）磷酸化的直接抑制相联系；雷公藤甲素则依赖ROS蓄积并选择性激活caspase-3/GSDME分支，而未明显涉及caspase-1/GSDMD。宝藿苷I在诱导GSDME焦亡的同时抑制DNA修复蛋白（包括EXO1、FEN1、PARP1、RAD51、RAD1和RAD9A），这可能解释其报道的与顺铂（cisplatin）协同作用。

综上，天然产物并未激活单一通用机制，而是反复涉及炎症小体/GSDMD或caspase-3/GSDME两条执行路线，ROS在两者中均常作为上游但非特异性信号。NLRP3的反复活化应主要被视为炎症小体/应激感受枢纽的汇聚，而非每种化合物均直接靶向NLRP3的证据；仅在Smurf2相关NLRP3稳定化、TLR4稳定化或特定非编码RNA和DDX3X/SQSTM1轴等研究中，上游证据才相对明确。

3.2 Cuproptosis

铜死亡研究仅有2项，应视为早期临床前证据。黄腐酚（xanthohumol）和PEG化氟菌素C脂质体制剂（PEG-FlpC）均指向铜依赖性线粒体应激这一中心事件，但路径不同。黄腐酚激活叉头框蛋白O1（forkhead box O1, FOXO1）-GADD45G轴，增加细胞内铜蓄积，上调溶质载体家族31成员1（solute carrier family 31 member 1, SLC31A1）和DLAT，并改变多种铜死亡相关线粒体蛋白，包括下调铁氧还蛋白1（ferredoxin 1, FDX1）、硫辛酸合成酶（lipoic acid synthase, LIAS）、乌头酸酶2（aconitase 2, ACO2）和电子转移黄素蛋白脱氢酶（electron-transferring-flavoprotein dehydrogenase, ETFDH）。整体呈现铜超载、铁-硫蛋白稳态破坏、线粒体功能障碍和氧化应激。

PEG-FlpC表现出更广泛的混合表型：下调ATP7B和CDKN2A，同时上调金属调节转录因子1（metal-regulatory transcription factor 1, MTF1）、DLAT、转铁蛋白受体（transferrin receptor, TFRC）、肌醇需求酶1（inositol-requiring enzyme 1, ERN1）、SQSTM1、RIPK3及线粒体膜扰动标志物；同时抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）和溶质载体家族7成员11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11），提示与铁死亡易感性存在交叉。四硫代钼酸盐（tetrathiomolybdate, TTM）较铁死亡抑制剂Fer-1更能拯救细胞活力，支持主要信号为铜介导死亡。这表明肺癌细胞中的铜死亡可能与更广泛的线粒体和氧化应激程序并存，而非孤立通路。

3.3 Necroptosis

坏死性凋亡主要由RIPK信号驱动，但周围生物学事件在不同研究中存在差异。较典型的例子是11-甲氧基长春碱（11-methoxytabersonine, 11-MT）和苦参碱（matrine）。二者均增强RIPK1/RIPK3相关信号，支持坏死性凋亡框架。在11-MT处理细胞中，RIPK1-RIPK3相互作用、坏死小体（necrosome）形成和LDH释放增加，同时通过腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）激活、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）抑制和c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）激活诱导自噬；该自噬表现为保护性而非致死性，阻断自噬反而增强坏死性凋亡。这提示非凋亡性死亡在癌细胞中常以不同应激反应竞争的形式展开。苦参碱同样升高RIPK1和RIPK3，但也伴随凋亡相关标志物上升，提示为混合死亡表型而非纯净坏死性凋亡。

更复杂的模式见于2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃醌（2-methoxy-6-acetyl-7-methyljuglone, MAM）、Bulnesia sarmientoi超临界流体提取物（BSE）和薯蓣皂苷元（diosgenin, DG）。MAM激活RIPK1/RIPK3并促进其磷酸化及复合物形成，驱动ROS/JNK/Ca²⁺环路，导致溶酶体膜透化（lysosomal membrane permeabilization, LMP）、组织蛋白酶B（cathepsin B）释放、线粒体功能障碍和线粒体膜电位下降；其机制被描述为肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）非依赖和混合谱系激酶样蛋白（mixed lineage kinase domain-like pseudokinase, MLKL）非依赖，显示肺癌中的坏死样死亡可偏离最简化的经典模式。BSE更接近TNF-α/RIPK1/RIPK3模型，且未观察到前体caspase-8明显活化。DG则主要通过破坏细胞分裂相关基因导致多核化和子细胞融合，同时升高ROS、RIPK3和MLKL，提示由有丝分裂和膜运输严重紊乱触发的坏死样状态。

总体而言，坏死性凋亡数据强化了RIPK1/RIPK3信号这一核心框架，但也显示其强烈交叉于氧化应激、Ca²⁺信号、溶酶体损伤、线粒体功能障碍、自噬，有时甚至伴随凋亡相关读数。

3.4 Translational feasibility, dose-response, and therapeutic window

现有证据尚未确立体外有效浓度在临床可达。多数研究使用细胞培养浓度和短期暴露窗口，部分包含异种或同种移植给药数据，但血浆和肿瘤内暴露、生物利用度、代谢稳定性、给药途径及人体等效剂量等药代动力学参数鲜有报道。因此，体外活性不可直接外推为体内可行性。

治疗窗亦未充分界定。正常细胞对照仅在少数研究中报告，系统比较癌细胞与正常肺上皮或成纤维细胞模型的研究较少。联合治疗声明尤其初步：抗PD-1或顺铂的协同报道来自单个临床前研究，尚未形成可重复的剂量、顺序、周期、毒性框架、药代动力学靶点或生物标志物指导选择策略。未来转化优先级应要求剂量-反应曲线、IC₅₀或暴露-反应范围、癌与正常细胞的对比、药效学生物标志物、给药途径可行性、重复给药毒性，以及耐受体内暴露下发生通路活化的证据。

3.5 Chemical diversity, SAR limitations, and pathway generalizability

纳入研究不支持正式的SAR结论。同一广义类别的化合物并不一致地映射到单一死亡方式，而不同类别却汇聚于相似的下游枢纽。例如，黄酮类化合物既可见于GSDMD相关焦亡，也见于GSDME相关焦亡和黄腐酚的铜死亡研究；生物碱类则分布于焦亡和坏死性凋亡中。这表明仅凭骨架身份不足以预测肺癌模型中的焦亡、铜死亡或坏死性凋亡。

更可辩护的概括是功能性的而非纯粹结构性的。许多活性药物被报道可扰动氧化应激、内质网应激、线粒体功能、DNA损伤反应、溶酶体完整性、金属离子处理或炎症信号。这些功能属性或可解释为何结构多样的天然产物会汇聚于ROS/NLRP3、caspase-3/GSDME、铜-DLAT线粒体应激或RIPK1/RIPK3等应激响应枢纽。然而，缺乏匹配类似物、标准化暴露、靶点结合验证和正交拯救实验之前，这些共性应仅作为未来药物化学和机制研究的假说。

4 Study limitations

本综述存在多项局限。证据基础全部为临床前研究，且被狭窄的NSCLC细胞系（尤其是A549）主导，限制了跨肺癌生物学多样性的外推。铜死亡研究数量极少，相关部分属初步探索。许多研究依赖LDH释放、ROS蓄积和膜损伤等重叠性读数，这些虽可支持裂解性或应激相关性死亡，但若无拯救、抑制、敲低或过表达实验，难以干净区分不同通路。"天然产物"涵盖化学多样性药物，纳入研究并非为支持正式SAR分析或骨架水平预测而设计。仅纳入英文发表的原始文章并存在正向机制叙述偏好，可能存在发表偏倚和选择性机制报告。安全性数据、正常细胞对照、药代动力学背景、标准化剂量-反应比较、联合用药顺序数据及治疗窗信息均有限。

5 Future directions

未来研究应突破当前以A549为中心的临床前格局，在基因组注释的NSCLC、耐药NSCLC、SCLC、患者来源类器官、共培养系统和免疫健全体内模型中进行验证。机制研究应采用标准化定义和扰动验证，包括GSDMD或GSDME敲低/拯救、caspase抑制、RIPK1/RIPK3/MLKL抑制或拯救、铜螯合/拯救，以及正交区分焦亡、铜死亡、坏死性凋亡、凋亡、铁死亡和继发性坏死的检测。SAR导向工作应使用匹配类似物、可比暴露窗口、定量靶点结合和标准化读数。转化研究需明确剂量-反应关系、药代动力学、给药途径、正常细胞毒性和治疗窗；将GSDMD或GSDME切割、IL-1β/IL-18释放、RIPK磷酸化、DLAT聚集或铜应激标志物等药效学生物标志物纳入标准化体内验证框架。联合化疗或抗PD-1治疗的假说应在样本量充足、剂量和顺序明确、毒性监测及生物标志物终点齐备的临床前模型中复现。

6 Conclusion

天然产物可通过触发或调节非凋亡性调控性细胞死亡（主要为细胞焦亡，铜死亡和坏死性凋亡证据有限）来抑制肺癌。当前证据在焦亡领域最强，但仍属临床前、模型有限且机制强度不均。铜死亡和坏死性凋亡的发现虽有前景，但尚处不成熟阶段，仅具假说生成价值。本综述应作为结构化临床前证据图谱，而非确定性SAR框架或临床治疗指南。细胞活力、增殖、迁移、侵袭或肿瘤生长的降低应被视为抗肿瘤表型，而非通路依赖性的直接证明，除非得到扰动或拯救实验支持。与抗PD-1或顺铂的联合结果需在重复、标准化剂量和顺序、药代动力学与毒性评估及生物标志物验证之后方可临床转化。