组氨酸积累降低灿烂弧菌（Vibrio splendidus）持留菌对四环素的敏感性

《Environmental Microbiology Reports》：Accumulation of Histidine Reduce the Susceptibility of Vibrio splendidus Persister Cells to Tetracycline

　　

灿烂弧菌（Vibrio splendidus）是一种广泛分布于海洋环境、动物组织及海底沉积物中的机会性病原菌，可感染多种海洋动物，导致高死亡率和重大经济损失。高浓度四环素暴露可诱导灿烂弧菌形成持留菌（persister cells），该亚群表现出对多种类别抗生素的耐受性，并通过促进疾病暴发对水产养殖构成严重威胁。既往研究表明，代谢调控是维持持留菌休眠及低能量状态的关键机制。本研究中，研究人员发现组氨酸衍生代谢物的积累显著降低了灿烂弧机械的群体感应和应激反应。通过对比不同生长阶段的基因表达谱，研究人员发现四环素诱导的持留菌中组氨酸生物合成及降解相关基因显著上调。为进一步探索该机制，研究人员采用外源性组氨酸补充及3-氨基-1,2,4-三唑（3-amino-1,2,4-triazole, 3-AT）处理以调节胞内组氨酸水平。值得注意的是，组氨酸及其相关代谢物的积累降低了胞内四环素浓度并增强了水产养殖病原菌灿烂弧菌对四环素的耐受性。此外，组氨酸增强了膜电位并上调了外排泵基因tolC的表达，从而促进了四环素诱导持留菌的形成。这些发现揭示了组氨酸代谢在抗生素耐受性中的未曾被认知的作用，为理解灿烂弧菌持留菌的形成提供了理论基础。

本研究围绕灿烂弧菌这一重要的水产养殖病原菌展开，聚焦于四环素诱导持留菌形成的代谢调控机制，特别是组氨酸代谢在该过程中的关键作用。灿烂弧菌为革兰氏阴性杆菌，可引起刺参（Apostichopus japonicus）皮肤溃疡综合征，广泛分布于海水、沉积物及多种海洋生物的组织或器官中。水产养殖中抗生素的预防性或治疗性使用会对天然细菌群体施加选择压力，可能促进这些环境中抗生素耐受性的发展，而持留菌作为细菌群体中能够耐受高浓度抗生素杀菌效应的休眠亚群，其表型持久性广泛存在于细菌病原体中，对人类及水产养殖中的慢性感染频繁复发具有重要贡献。

目前关于持留菌的形成机制研究表明，营养缺乏、环境变化、氧化应激、胞外信号分子及抗菌药物等均可诱导持留菌形成，细菌通过降低三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）水平、增加蛋白质聚集体形成、抑制脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid, DNA）复制或转录、阻滞翻译及降低胞内抗生素浓度等机制形成持留菌。近年来，细菌代谢自调控在持留菌形成中的作用受到关注，多项研究探索了中心碳代谢、脂肪酸代谢等途径对细菌药物耐受性的调控作用。然而，组氨酸代谢如何调控灿烂弧菌持留菌的形成及耐受性尚不清楚。

本研究的主要发现可概括为以下三个部分：

**3.1 灿烂弧菌持留菌的特征及生长阶段依赖性**

研究人员通过连续稀释法测定四环素对灿烂弧菌的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为25 μg/mL，并定义经10×MIC四环素处理4小时后存活的细胞为持留菌。观察发现，持留菌数量随培养时间延长而增加，可能与培养基中营养耗尽相关。在OD₆₀₀为0.6和1.2时，单细胞呈长杆状，而在OD₆₀₀=2.0时呈小球状。使用环丙沙星、卡那霉素、氨苄西林等不同抗生素诱导持留菌的结果显示，持留菌形成率同样随培养时间延长而增加。

**3.2 转录组基因本体论（Gene Ontology, GO）分析中组氨酸代谢的富集**

在四环素诱导的持留菌差异上调代谢通路中，组氨酸代谢显著富集。对VS0.6/VST0.6、VS1.2/VST1.2和VS2.0/VST2.0（VS：活跃期灿烂弧菌细胞；VST：四环素诱导的灿烂弧菌持留菌）的转录组比较分析显示，组氨酸代谢通路在VST2.0中显著上调。组氨酸生物合成以磷酸核糖焦磷酸（phosphoribosyl pyrophosphate, PRPP）为起始代谢物，由his操纵子编码相关酶，包括hisG、hisE、hisI、hisA、hisF、hisH、hisB、hisC、hisN和hisD等基因。转录组每千碱基外显子序列片段数（fragments per kilobase of exon model per million reads mapped, FPKM）数据显示，除hisG和hisD下调外，四环素诱导持留菌中大多数his操纵子基因表达增加。此外，组氨酸分解代谢通路相关基因在四环素诱导持留菌中也发挥关键作用，可能有助于持留菌在抗生素胁迫下的存活。

**3.3 组氨酸积累增强持留菌形成**

研究人员通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量分析不同生长阶段灿烂弧菌的胞内组氨酸浓度，发现四环素诱导持留菌在OD₆₀₀=0.6和OD₆₀₀=1.2时的胞内组氨酸水平显著高于活跃期细胞。外源性组氨酸补充实验显示，在所有生长阶段均以剂量依赖方式增强持留菌存活：在OD₆₀₀=0.6时，1、3、5和20 mM组氨酸分别使持留菌存活增加36倍、55倍、267倍和289倍；在OD₆₀₀=1.2时，相应存活率分别为对照的0.55倍、0.65倍、15倍和76倍。由于组氨酸代谢与嘌呤代谢存在相互负反馈调控，嘌呤类似物（6-巯基嘌呤）处理导致胞内组氨酸浓度剂量依赖性增加，进而使持留菌形成率相应升高。相反，使用组氨酸生物合成抑制剂3-AT处理可降低胞内组氨酸浓度，并导致四环素诱导持留菌存活率剂量依赖性下降。

**3.4 组氨酸存在下质子 motive 力（proton motive force, PMF）增加刺激抗生素外排**

研究人员探究了组氨酸调控外排泵活性的机制。使用DiOC₂(3)（膜电位荧光探针）检测发现，组氨酸处理显著增加灿烂弧菌膜电位，表明PMF升高。与之一致的是，随着组氨酸浓度增加，胞内四环素水平下降，且外排泵基因tolC表达显著上调。转录组分析还显示ATP结合盒（ATP-binding cassette, ABC）转运体通路相关基因的FPKM值显著增加，表明组氨酸通过增强PMF和外排泵基因表达促进四环素外排，从而增强持留菌形成。

**3.5 外源性组氨酸对不同抗生素诱导持留菌耐受性的差异化调控**

为评估外源性组氨酸对持留菌抗生素耐受性的影响是否具有四环素特异性，研究人员测试了氨苄西林、卡那霉素和环丙沙星处理。结果显示，外源性组氨酸与氨苄西林共处理显著增加持留菌存活，但对卡那霉素或环丙沙星无显著影响，表明外源性组氨酸特异性增强持留菌对四环素和氨苄西林的耐受性。

在讨论部分，研究人员将本研究与既往关于代谢网络调控与细菌抗生素耐受性持久性的研究进行了对比。本研究中，四环素作为抑制核糖体翻译的抗生素，相比卡那霉素、氨苄西林和环丙沙星诱导了更高水平的持留率和更深的休眠状态。转录组分析显示抗生素诱导持留菌中上调基因数量为下调基因的1.5倍，其中核糖体代谢广泛下调，而组氨酸代谢通路在上调基因中尤为突出。研究人员特别注意到hisG和hisD这两个组氨酸生物合成关键酶基因的下调可能与组氨酸浓度升高时的负反馈调控相关。关于外排泵机制，研究人员指出膜转运蛋白介导的抗生素外排是革兰氏阴性病原菌固有和获得性耐受的主要机制，外排泵活性与膜电位密切相关。本研究中组氨酸补充升高膜电位并增强主要外排泵基因tolC的表达，导致胞内四环素水平降低，这与氨基酸代谢物调控外排泵和膜电位的研究趋势一致，但不同氨基酸的具体效应存在差异，如碱性精氨酸可增强沙门氏菌对庆大霉素的杀伤敏感性，与本研究中组氨酸促进四环素耐受的效应形成对比。

研究结论部分指出，本研究表明外源性组氨酸通过增强胞内组氨酸积累、提高PMF及上调外排泵基因表达，增强灿烂弧菌持留菌在四环素压力下的存活。相反，使用3-AT抑制组氨酸生物合成可有效抑制持留菌形成。这些结果强调了组氨酸代谢作为灿烂弧菌持留状态关键调控通路的重要性，为水产养殖中预防和消除四环素诱导灿烂弧菌持留菌的策略开发奠定了理论基础。该论文发表于《Environmental Microbiology Reports》。