《Genes to Cells》：The SQSTM1 L341V Variant Associated With Sporadic ALS Promotes the Accumulation of Enlarged Ubiquitin-Positive SQSTM1 Bodies
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SQSTM1（sequestosome 1）是神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）的致病基因之一。SQSTM1蛋白通过其与微管相关蛋白轻链3（MAP1LC3/LC3）的相互作用，调节多聚泛素化蛋白的降解和自噬体形成。然而，SQSTM1
SQSTM1（sequestosome 1）是神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）的致病基因之一。SQSTM1蛋白通过其与微管相关蛋白轻链3（MAP1LC3/LC3）的相互作用，调节多聚泛素化蛋白的降解和自噬体形成。然而，SQSTM1-LC3结合调控自噬-内溶酶体系统（APELS）的分子机制尚不清楚。为阐明SQSTM1的时空作用，研究人员瞬时表达了与光转换荧光蛋白Dendra2融合的野生型SQSTM1或在LC3相互作用区（LIR）携带错义突变的突变体。随后进行了活细胞荧光成像以及与APELS标记物的共定位分析。对活细胞中光转换或非光转换的SQSTM1阳性结构的颗粒分析显示，致病性L341V变异体形成的结构比野生型更大。共定位分析进一步表明，L341V和人工LIR3A突变体均积聚在大的泛素阳性结构中，这可能是由于向自噬体定位受损所致。这些结果表明，LIR内的突变对APELS相关区室内的自噬体形成和货物降解有不同的影响，突出了SQSTM1结构完整性在ALS/FTD发病机制中的重要性。
**研究背景与意义**
肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）是遗传、病理和临床上相关的进行性神经退行性疾病，统称为ALS/FTD。许多ALS/FTD相关基因编码的蛋白质参与自噬-内溶酶体系统（APELS），这为理解由于蛋白水解通路功能障碍导致蛋白质稳态破坏的分子机制提供了见解。SQSTM1（亦称p62）是其中一个ALS-FTD相关基因。SQSTM1蛋白是一种多功能衔接蛋白，通过其C端泛素相关（UBA）结构域作为泛素化货物分子的衔接蛋白，并经由其LC3相互作用区（LIR）与微管相关蛋白轻链3（LC3）相互作用，在APELS内的货物降解和自噬体形成中发挥关键作用。SQSTM1已知在通过APELS降解泛素化蛋白质以及响应氧化应激时形成凝聚结构，称为SQSTM1体。一个在散发性ALS患者中发现的SQSTM1错义变异体SQSTM1_L341V，先前已被证明与野生型蛋白相比，形成更球形但流动性较低的细胞质结构。前期研究表明，SQSTM1_L341V相对于野生型对LC3的结合亲和力降低。然而，LIR突变对自噬体形成、泛素阳性凝聚物形成以及APELS内蛋白水解的具体影响仍不清楚。因此，阐明SQSTM1通过LC3结合调控APELS的分子机制，对于理解SQSTM1相关ALS/FTD的发病机制至关重要。本研究旨在通过活细胞颗粒分析和与APELS相关细胞器的共定位分析，探究SQSTM1体的细胞内动力学。
**关键技术方法概述**
研究人员构建了与光转换荧光蛋白Dendra2融合的野生型（WT）SQSTM1、ALS相关的LC3亲和力缺陷变异体（L341V）或人工LC3亲和力缺陷突变体（LIR3A）的表达载体。使用人宫颈癌细胞系（HeLa细胞）进行瞬时转染和表达。通过活细胞延时荧光成像技术，在正常培养、血清饥饿（激活自噬）以及使用巴弗洛霉素A1（BafA1）抑制自噬（抑制溶酶体酸化和APELS相关蛋白水解）三种条件下，对Dendra2-SQSTM1进行光转换，并跟踪分析未转换（绿色，代表新合成）和已转换（红色，代表预先存在）的SQSTM1阳性结构（SQSTM1体）在光转换后4.5小时内的尺寸和数量变化。此外，通过免疫荧光染色和共定位分析（使用Mander's tM2系数），评估了SQSTM1体与自噬体标记物LC3、溶酶体标记物LAMP1、顺式高尔基体标记物GM130以及泛素（Ub）的共定位情况。
**研究结果分析**
**2.1 LC3亲和力缺陷的SQSTM1 L341V变异体在正常培养条件下倾向于形成比野生型或人工LIR3A突变体更大的SQSTM1体**
活细胞成像和颗粒分析显示，在正常培养条件下，L341V组中未转换和已转换的SQSTM1体在所有时间点都倾向于比WT组更大，尽管未达到统计显著性。LIR3A组的SQSTM1体尺寸与WT组相当。各组间SQSTM1体的数量无显著差异。随时间推移，WT组的SQSTM1体尺寸无显著变化；L341V组未转换和已转换SQSTM1体的尺寸均呈现增加趋势；LIR3A组则无显著变化。已转换SQSTM1体的数量在所有组中均呈现随时间减少的趋势。
**2.2 在自噬激活条件下，LC3亲和力缺陷的SQSTM1 L341V变异体形成比野生型或人工LIR3A突变体更大的SQSTM1体**
在血清饥饿（激活自噬）条件下，L341V组未转换SQSTM1体在光转换前、后及第一个时期的尺寸显著大于WT组。已转换SQSTM1体在L341V组的第一和第二时期也大于WT组。LIR3A组与WT组相比无显著尺寸差异。在数量上，L341V和LIR3A组的SQSTM1体在所有时期均倾向于多于WT组，但未达显著性。LIR3A组的已转换SQSTM1体数量在所有时间点均持续倾向于高于其他组。
**2.3 自噬抑制增加了致病性SQSTM1变异体中SQSTM1体的数量**
在血清饥饿并加入BafA1（抑制自噬）的条件下，BafA1处理有效抑制了SQSTM1的APELS相关降解，表现为WT和L341V组中已转换SQSTM1体数量的显著增加。在变异体间比较中，L341V组未转换SQSTM1体在第二和第三时期倾向于比WT和LIR3A组更大。已转换SQSTM1体在L341V组所有时期均大于WT组，LIR3A组在第二时期显著大于WT组。在数量上，L341V组未转换SQSTM1体在多个时期计数高于WT组。LIR3A组未转换SQSTM1体数量与WT组相当，而已转换SQSTM1体数量倾向于持续低于WT或L341V组。
**2.4 LC3亲和力缺陷的SQSTM1 L341V和LIR3A突变体未能定位于自噬体和溶酶体**
共定位分析表明，与WT组相比，LIR3A组在大多数时间点和条件下，其SQSTM1体与LC3的共定位系数显著降低。L341V组与LC3的共定位也倾向于低于WT组，但多未达统计显著性。与溶酶体标记物LAMP1的共定位在L341V组于正常条件下2小时时显著低于WT组，且两个突变体组的LAMP1共定位普遍低于WT组。这些结果表明，LIR3A突变体几乎不与自噬体/溶酶体共定位，而L341V变异体在血清饥饿条件下部分保留了向自噬体定位的能力，但效率低于WT。
**2.5 SQSTM1体与顺式高尔基结构的共定位有限**
与顺式高尔基体标记物GM130的共定位分析显示，所有组在所有条件下的平均系数值均较低（小于0.3），表明SQSTM1体与顺式高尔基膜结构的共定位有限。各组间及各时间点内均无显著差异。
**2.6 SQSTM1体适度定位于泛素阳性结构**
与泛素（Ub）的共定位分析显示，WT、L341V和LIR3A三组间在所有条件下的共定位系数均无显著差异。然而，L341V和LIR3A变异体的共定位系数值分布更集中于0.4左右，而WT组分布更分散。值得注意的是，在L341V或LIR3A表达细胞中，大多数增大的SQSTM1体似乎与Ub共定位，而同一细胞内的其他SQSTM1体则不共定位。这些结果表明，Ub与LC3亲和力缺陷变异体的共定位倾向于集中在中等水平。
**讨论与结论总结**
讨论部分指出，本研究表明ALS相关的SQSTM1 L341V变异体积累了增大的、泛素阳性的、类似凝聚物的结构，而人工LIR3A突变体则形成更多不与APELS相关标记物共定位的SQSTM1体。这与在ALS/FTD患者病理组织中观察到的SQSTM1在泛素阳性聚集体中积累的现象一致。研究人员提出，L341V可能保留了与多聚泛素化蛋白结合的能力，但由于LC3相互作用受损，其被募集到自噬体的效率降低，从而导致泛素阳性聚集体的积累，这可能促进ALS/FTD中的蛋白质毒性。研究还探讨了SQSTM1通过液-液相分离（LLPS）形成细胞质液滴样结构的可能性，并指出位于SQSTM1中央本质无序区（IDR）的LIR可能在SQSTM1体形成和/或自噬货物募集过程中发挥关键作用。同时，研究也指出了本研究的局限性，包括使用了HeLa细胞过表达系统、共定位分析方法的局限性以及无法明确区分自噬流受损与SQSTM1体组成改变等，并提出了未来需要进一步研究的方向。
**研究结论部分翻译：**
本研究证明，与ALS相关的SQSTM1变异体L341V表现出异常的细胞内时空动力学，并形成让人联想到ALS/FTD病理特征的泛素阳性聚集体。研究结果强调了SQSTM1作为蛋白水解通路中货物衔接蛋白的重要性，其功能复杂地依赖于其分子结构。尽管精确的分子机制仍有待充分阐明，但数据表明包括LIR在内的IDR在SQSTM1体形成和货物募集过程中起着关键作用。需要进一步的研究来阐明SQSTM1的结构特征与ALS/FTD发病机制之间的机制联系。
