单核细胞谱系细胞而非经典树突状细胞上的4-1BBL驱动呼吸道CD8+ T细胞积聚并抵抗严重流感病毒感染

《Mucosal Immunology》：4-1BBL on monocyte lineage cells rather than on classical dendritic cells drives CD8+ T cell accumulation in the respiratory tract and protects from severe respiratory influenza infection

　　

季节性的流行以及对大流行持续存在的威胁，促使深入理解针对流感病毒感染的保护机制成为当务之急。T细胞内源性信号通过肿瘤坏死因子受体（TNFR)超家族成员4-1BB通路，对于抗原特异性CD8⁺效应T细胞（T_EFF)和组织驻留记忆T细胞（T_RM)在肺部的积聚以及抵抗甲型流感病毒（IAV)感染至关重要。然而，提供4-1BB配体（4-1BBL)的抗原提呈细胞（APC)尚不明确。本研究利用单细胞RNA测序（scRNA-seq)和多参数流式细胞术，在急性IAV感染期间定义了小鼠单核细胞谱系细胞（MC)和经典树突状细胞（cDC)的群体，并显示CD64⁺MAR-I⁺CD26^?炎症性单核细胞谱系细胞（infMC)上的4-1BBL表达水平高于MHC II^hiCD11c⁺CD26⁺ cDC。通过Ccr2依赖性细胞上4-1BBL特异性缺失的混合骨髓嵌合体，以及利用Ccr2-Cre或Zbtb46-Cre驱动的条件性敲除，研究人员证明MC而非cDC上的4-1BBL对于核蛋白（NP)特异性CD8⁺效应T细胞和组织驻留记忆T细胞的积聚至关重要。重要的是，Ccr2依赖性细胞上的4-1BBL对于小鼠在严重IAV感染后的存活至关重要。这些发现揭示了cDC与MC之间的功能分工，即infMC独特地提供4-1BBL以增加CD8⁺ T细胞在肺部的积聚并保护机体免受严重IAV感染。

该研究发表于《Mucosal Immunology》，旨在阐明不同抗原提呈细胞（APC)亚群上的共刺激分子4-1BB配体（4-1BBL)如何参与调控抗甲型流感病毒（IAV)的CD8⁺ T细胞应答。流感病毒的季节性流行及潜在的大流行威胁，使得深入理解抗IAV保护机制成为当务之急。现有研究表明，T细胞通过肿瘤坏死因子受体（TNFR)超家族成员4-1BB的内源性信号通路对抗病毒免疫至关重要，但提供4-1BBL的具体APC类型长期缺乏明确界定。经典树突状细胞（cDC)被认为在T细胞 priming 中发挥核心作用，而单核细胞谱系细胞（MC)与cDC之间存在显著的表型重叠，尤其在炎症条件下，这使得准确区分两类细胞并解析其功能分工变得困难。研究人员因此开展此项研究，以期明确4-1BBL的细胞来源及其在呼吸道抗流感免疫中的特定功能。

该研究的关键技术方法包括：利用C57BL/6小鼠构建IAV PR8亚致死和致死剂量感染模型；采用10× Genomics平台进行单细胞RNA测序（scRNA-seq)，对感染后第5天肺部CD45⁺CD3^?CD19^?MHC II⁺细胞进行无偏态分群；运用多参数流式细胞术结合UMAP降维和FlowSOM聚类算法验证细胞群体，并建立基于CD26/CD88/CD64/MAR-1等标志物的分群策略；构建Ccr2^?/?:4-1bbl与Ccr2成员单位4-1bbl^?/?的混合骨髓嵌合体以及4-1bbl^exon3fl/flCcr2^Cre和4-1bbl^exon3fl/flZbtb46^Cre条件性基因敲除小鼠，实现MC或cDC特异性4-1BBL缺失；采用H-2D^b/NP_366–374和H-2D^b/PA_224–233四聚体及细胞内细胞因子染色追踪抗原特异性CD8⁺ T细胞应答，并通过静脉注射抗CD8抗体区分血管与肺实质淋巴细胞。

研究结果部分：

scRNA-seq绘制IAV感染期间小鼠肺组织MHC II⁺细胞图谱

研究人员对IAV感染后第5天肺部的MHC II⁺细胞进行scRNA-seq分析，该时间点为单核细胞肺部积聚峰值。质控后从5,313个细胞中鉴定出9个簇，包括3个巨噬细胞簇、3个单核细胞谱系细胞簇和3个树突状细胞簇。组织驻留肺泡巨噬细胞（TR-AM)高表达Marco、Siglecf、Chil3、Car4和C5ar1（编码CD88)；间质巨噬细胞（IM)表达Mafb、Apoe、Csf1r、Fcgr1和Ms4a7。单核细胞簇进一步分为表达Ly6c2和Ccr2的经典单核细胞（Ly6C^hi Mo)，以及表达高水平Cx3cr1但低水平Ly6c2和Ccr2的非经典单核细胞（Ly6C^lo Mo)。炎症性单核细胞谱系细胞（infMC)簇共享核心单核细胞转录特征，同时高表达Fcgr1（编码CD64)和I型干扰素信号相关基因（Isg15、Isg20、Ifi205、Ifit1–3及Irf7)。cDC簇以Zbtb46、Dpp4（编码CD26)和Flt3为标记，分为表达Batf3、Irf8、Xcr1和Clec9a的cDC1，以及表达Irf4的cDC2。浆细胞样DC（pDC)表达Siglech和Irf8但缺乏Zbtb46。进一步重聚类分析显示，簇6为表达Tmem176a、Skint3、Hpgd、Fcgr3和Fcgr2b的独特DC3群体，与脾脏DC3高度相关；而infMC簇与任何脾脏DC簇均无显著对应。此部分结果建立了急性IAV感染期间肺部MHC II⁺细胞的无偏态转录组图谱。

流式细胞术验证scRNA-seq描述的MHC II⁺群体

研究人员采用18色表面标志物 panel 进行多参数流式细胞术，结合UMAP和FlowSOM算法对感染后第5天肺部细胞进行无监督聚类，鉴定出14个元簇。B细胞、T细胞、pDC、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和肺泡巨噬细胞在UMAP上清晰分离。其余群体依据CD26与CD88的互斥表达分为单核细胞/巨噬细胞（CD26^?CD88⁺)和cDC（CD26⁺CD88^?)两大组。单核细胞/巨噬细胞亚群包括infMC（CD11b⁺CD64⁺MAR-1⁺)、经典单核细胞/巨噬细胞（CD11b⁺Ly6C⁺CD64⁺F4/80⁺)和非经典单核细胞（CD11b⁺Ly6C^?)。cDC亚群包括cDC1（XCR1⁺CD11b^?)、cDC2a（XCR1^?CD11b^+/?Clec12A^?)、cDC2b（XCR1^?CD11b⁺Clec12A⁺)和DC3（表达CD16/32的cDC2b样细胞)。Zbtb46、CD26在cDC1、cDC2和DC3上表达最高，而CD88在巨噬细胞和infMC上高表达。该验证性分析确认了scRNA-seq鉴定的细胞群体，并建立了可靠的分群策略。

infMC是IAV感染期间表达4-1BBL蛋白的主要细胞

研究人员在感染后0、1、3、5和7天检测肺部和引流淋巴结（dLN)中4-1BBL的表达动态。结果显示，非免疫细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和pDC在任何时间点均未显著上调4-1BBL。在肺部髓系APC中，CD11b⁺F4/80⁺巨噬细胞、infMC、cDC2和DC3均在感染后显著上调4-1BBL，峰值出现于第5–7天；而dLN中仅cDC1显著上调4-1BBL。定量分析显示，4-1BBL⁺细胞在肺部的数量远高于dLN，且肺部表达峰值显著高于dLN。第5–7天时，infMC是肺部最丰富的APC群体。综合考虑4-1BBL表达水平和细胞数量，infMC构成了IAV感染早期4-1BBL的主要来源。

Ccr2依赖性细胞上的4-1BBL促进NP特异性CD8⁺效应T细胞积聚并增加肺部T_RM数量

研究采用CD45.1.2 Ccr2^?/?:CD45.2 4-1bbl^+/+（WT嵌合体)与CD45.1.2 Ccr2^?/?:CD45.2 4-1bbl^?/?（KO嵌合体)的混合骨髓嵌合策略，使Ccr2依赖性细胞特异性缺失4-1BBL。验证显示，循环单核细胞中超过90%来源于4-1bbl^+/+（WT)或4-1bbl^?/?（KO)供体，而CD8⁺ T细胞以接近1:1比例重建。感染后分析显示，WT嵌合体肺部NP<sub>366–374特异性CD8⁺ T细胞在感染后第10天于肺血管和肺实质中均显著高于KO嵌合体，但脾脏无差异；而PA224–233特异性CD8⁺ T细胞在两组间无显著差异。第30天时，WT嵌合体肺实质中TRM（CD69⁺，含CD103⁺和CD103^?)数量显著增加，但组织限制性TEM无变化。体外肽再刺激实验显示，WT嵌合体中NP肽刺激的IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞数量呈边缘性降低趋势（p=0.054)，而PA肽刺激组无差异；但单个细胞产生IFN-γ的能力（MFI)在两组间无差异。这些结果表明，Ccr2依赖性MC上的4-1BBL是NP特异性而非PA特异性CD8⁺ TEFF和TRM最大积聚所必需的，且不影响单个细胞的效应功能水平。

Ccr2表达细胞而非Zbtb46表达细胞上的4-1BBL支持NP特异性CD8⁺ T细胞积聚

为区分MC与cDC来源4-1BBL的贡献，研究人员构建4-1bbl^exon3fl/fl条件性敲除小鼠，并与Ccr2^Cre或Zbtb46^Cre交配。流式验证显示，4-1bbl^exon3fl/flCcr2^Cre/WT小鼠在infMC和cDC中均实现4-1BBL缺失，而4-1bbl^exon3fl/flZbtb46^Cre/WT小鼠仅在cDC和DC3中缺失、infMC保留。感染后分析显示：Ccr2^Cre介导的4-1BBL缺失导致第10天肺部NP特异性CD8⁺ TEFF减少，第30天TRM减少，TEM无变化，总细胞数和频率均无差异（但总TRM数减少)；脾脏无差异。相反，Zbtb46^Cre介导的缺失对NP特异性、PA特异性的TEFF和TRM均无影响。该结果进一步证实，zbtb46⁺细胞上的4-1BBL对于NP-和PA-特异性CD8⁺ T细胞应答均非必需，而Ccr2⁺细胞上的4-1BBL对NP特异性应答至关重要。

Ccr2依赖性MC上的4-1BBL保护小鼠免受严重IAV感染

为验证4-1BBL缺失的临床意义，研究人员对嵌合体和高剂量感染模型进行存活分析。混合骨髓嵌合体中，KO嵌合体（Ccr2依赖性细胞缺失4-1BBL)体重下降更快，第5天即出现差异，至第8天全部达到终点；而75%的WT嵌合体恢复存活。4-1bbl^exon3fl/flCcr2^Cre/WT小鼠及其Cre阴性对照的高剂量感染实验中，Cre阳性小鼠67%达到终点，显著高于Cre阴性对照的23%；幸存者的体重恢复也延迟。这些结果证明，Ccr2依赖性细胞（主要为MC)是4-1BBL的主要贡献者，对于抵抗严重IAV感染、保障存活至关重要。

研究结论：该研究通过scRNA-seq和流式细胞术系统绘制了IAV感染期间肺部MHC II⁺细胞的转录组和蛋白表达图谱，明确界定了infMC与cDC的群体特征。研究核心发现，CD64⁺MAR-I⁺CD26^? infMC是IAV感染期间4-1BBL的主要来源，而cDC2和DC3虽也表达4-1BBL但贡献有限。功能上，MC来源的4-1BBL特异性促进NP特异性CD8⁺ TEFF在肺组织的积聚和TRM的形成，但对PA特异性T细胞无显著影响，且不改变单个T细胞的效应功能水平。cDC来源的4-1BBL在该系统中可被完全替代。最终，MC来源的4-1BBL对于宿主在严重IAV感染中的存活具有决定性保护作用。这些发现确立了MC与cDC在T细胞共刺激中的功能分工，将MC来源的4-1BBL定义为继抗原/MHC（信号1)、CD28/B7（信号2)和细胞因子（信号3)之后的"信号4"，为呼吸道病毒感染的免疫干预和疫苗设计提供了新的靶点。</sub>