Gαo剪接变体亚型特异性缺失对小脑解剖结构与突触形成的影响

《Journal of Neurochemistry》：Splice Type-Specific Effects of Gαo Subunits on Cerebellar Anatomy and Synapse Formation

　　

本研究探讨了单个Gαo1与Gαo2单独敲除以及Gαo1/2双敲除对小鼠小脑解剖结构与突触形成的影响。G蛋白Go的α亚基（Gαo）存在两种剪接变体（splice variants）。特定Gαo亚型敲除可导致小鼠出现严重的——主要为运动方面的——功能缺陷，而人类该基因位点的突变可引起严重脑病（encephalopathies）。研究人员旨在阐明此前尚未完全了解的个体Gαo亚基对小脑解剖及突触形成的贡献。Gαo1敲除使小脑体积缩小约11%，伴中央小叶III（central lobule III）分子层厚度最大减少（?30%）及小结（uvula）分子层面积最大减少（?33%）。Gαo2敲除则增大小脑体积，中央小叶II（central lobule II）分子层厚度增加（+18.6%），首裂（culmen）分子层面积增加（+37%）。Gαo1/2双敲除使小脑体积缩小12%，斜坡（declive）分子层厚度与面积分别降低?27.3%和?23.4%。此外，Gαo1敲除小鼠浦肯野细胞（Purkinje cells, PCs）上VGLUT2（vesicular glutamate transporter 2）阳性的爬行纤维（climbing fiber, CF）接触平均减少40%；VGLUT1（vesicular glutamate transporter 1）表达亦降低（平均?17.3%）。Gαo2敲除促进爬行纤维接触（平均+14.3%，中央小叶II最高达+52.6%），VGLUT1受影响较小。双敲除小鼠VGLUT2总点数减少35%，VGLUT1表达平均降低23%。VGAT（vesicular GABA transporter）阳性抑制性突触接触在Gαo1与双敲除中也减少（分别?25%和?31%总数），Gαo2敲除则增加（平均+13%）。与之相符，Gαo1?/?与Gαo?/?小鼠浦肯野细胞树突向外生长受抑，而Gαo2敲除促进树突向外生长。综上，两种Gαo剪接变体对小脑血管发育发挥相反作用，其中Gαo1为主导亚基。

论文解读：Gα_o剪接变体亚型特异性缺失对小脑解剖结构与突触形成的影响

该研究发表于《Journal of Neurochemistry》。G蛋白Go的α亚基（Gα_o，由人类基因GNAO1编码）是中枢神经系统含量最丰富的G蛋白之一，存在Gα_o1和Gα_o2两种剪接变体（splice variants）。GNAO1基因突变可导致人类严重GNAO1脑病（表现为癫痫、运动障碍及认知损害），但两种剪接变体各自在小脑发育与突触形成中的具体功能尚不清楚。既往研究表明Gα_o1敲除致小鼠运动缺陷及纹状体多巴胺失衡，而Gα_o2敲除对神经元生长具促进作用，二者在培养神经元中呈拮抗效应；全Gα_o双敲除可致小脑皮质发育受损。鉴于小脑是运动整合的关键脑区且Gα_o在小脑分子层高度表达，研究人员通过构建Gα_o1^?/?、Gα_o2^?/?及Gα_o1/2^?/?（简称Gα_o^?/?）小鼠，系统比较各亚型缺失对小脑整体及分叶（folia）解剖参数、兴奋性（爬行纤维VGLUT2、平行纤维VGLUT1）与抑制性（VGAT）突触形成，以及浦肯野细胞（Purkinje cells, PCs）树突形态的影响，以阐明两剪接变体的差异化与主导性作用。研究发现Gα_o1与Gα_o2对小脑血管发育及突触形成具相反调控作用，Gα_o1敲除致小脑发育不全（hypoplasia）及突触联系减少，Gα_o2敲除呈促生长效应，双敲除表型近似Gα_o1单敲除，表明Gα_o1功能占主导地位，为理解GNAO1相关疾病的小脑病理机制提供解剖与突触水平依据。

主要关键技术方法

研究人员使用Gα_o1^?/?、Gα_o2^?/?及Gα_o1/2^?/?（Gα_o^?/?）小鼠及其野生型（WT）同窝对照，经心灌注固定后制作小脑正中矢状冰冻切片并进行免疫荧光染色（抗Calbindin标记PCs、抗VGLUT2标记爬行纤维突触、抗VGLUT1标记平行纤维突触、抗VGAT标记抑制性突触、抗Parvalbumin标记分子层中间神经元、抗Gα_o1/Gα_o2/Gα_o抗体验证敲除）。采用ImageJ进行小脑各小叶分子层与颗粒层面积及厚度测量、设定ROI（region of interest）行突触斑点（puncta）计数与密度分析、VGLUT1表达亮度分析及PCs树突宽度与树突面积量化。Western blotting验证蛋白缺失。Shapiro–Wilk检验正态性后，采用双尾非配对Student's t检验进行统计学分析。

研究结果

3.1 Expression and Effects of Gα_oSubunit Knockouts on Overall Cerebellar Anatomy and Cortex Size of Individual Folia（Gα_o亚基敲除对整体小脑解剖及各小叶皮质尺寸的表达与影响）

免疫荧光与Western blot确认各亚型及双敲除蛋白缺失。Gα_o1^?/?小鼠小脑总面积缩小11%（长、高均缩8.5%），分子层厚度在前部中央小叶III降幅最大（?30%），uvula分子层面积降33%；Gα_o2^?/?小鼠小脑总面积增10%、高增11.3%，中央小叶II分子层厚+18.6%，culmen分子层面积+37%；Gα_o^?/?小鼠小脑总面积缩12%、高缩15.3%，分子层面积缩19%，斜坡分子层厚与面积分别降?27.3%和?23.4%。小叶特异分析显示Gα_o1缺失主要抑制前叶及uvula分子层发育，Gα_o2缺失促进多数小叶分子及颗粒层增大，双敲除近似Gα_o1表型，说明Gα_o1主导小脑生长调控。

3.2 Effects of Gα_oSplice Isoform Knockouts on Excitatory Synaptic Contacts in the Cerebellar Cortex（Gα_o剪接异构体敲除对小脑皮质兴奋性突触接触的影响）

Gα_o1^?/?使分子层内VGLUT2阳性爬行纤维斑点总数降40%（密度?27.4%，斑点面积?20%），各小叶均降（culmen最大?50%）；Gα_o2^?/?使VGLUT2斑点总数增14.3%（中央小叶II最高+52.6%），密度与斑点尺寸部分增加；Gα_o^?/?使VGLUT2斑点总数降35%（密度?24%，面积?18.6%）。小叶Gα_o1与Gα_o2表达在fotulum-tuber-vermis最高、nodulus最低。VGLUT1亮度分析示Gα_o1^?/?平均降17.3%（四小叶显著），Gα_o2^?/?仅uvula增27.2%，双敲除平均降23%。斑点量化确认Gα_o1^?/?中央小叶II VGLUT1斑点数与密度显著降低，双敲除斜坡亦显著降低。表明Gα_o1缺失削弱兴奋性突触形成与传递标记物表达，Gα_o2缺失轻微促进爬行纤维突触。

3.3 Effects of Gα_oSplice Isoform Knockouts on Inhibitory Synaptic Contacts in the Cerebellar Cortex（Gα_o剪接异构体敲除对小脑皮质抑制性突触接触的影响）

Gα_o1^?/?使VGAT阳性抑制性突触斑点总数降25%（密度?18%），Gα_o2^?/?增13%，Gα_o^?/?降31%（密度?24%，斑点尺寸?18%）。小叶分析相应显示Gα_o1与双敲除多小叶抑制，Gα_o2敲除部分小叶促进。Parvalbumin阳性篮状/星状细胞计数在Gα_o1^?/?与Gα_o^?/?未见改变，Gα_o2^?/?仅在pyramis轻微增加。提示抑制性突触数量变化主要源于PCs树突复杂程度改变提供的突触位点数变化，而非抑制性中间神经元数量改变。

浦肯野细胞形态学结果

Gα_o1^?/?使中央小叶III与culmen PCs初级树突宽度分别缩24.8%与21.9%；Gα_o2^?/?使中央小叶III与uvula PCs初级树突略增（分别+6.2%、+5.2%）且uvula树突总面积增15.1%；Gα_o^?/?使中央小叶III与declive PCs初级树突宽缩（?26.9%、?25.7%）且declive树突总面积缩18.7%。表明Gα_o1缺失抑制PCs树突向外生长，Gα_o2缺失促进之，与分子层厚度变化相吻合。

讨论与结论总结

研究证明Gα_o1缺失导致小脑发育不全，主要表现为PCs树突生长受抑及分子层缩小，伴随VGLUT2/VGLUT1阳性兴奋性突触与VGAT阳性抑制性突触接触减少；Gα_o2缺失则呈反向——促进PCs树突向外生长、增大分子层及部分增强突触标记物。两剪接变体功能拮抗，且Gα_o1效应在双敲除中占主导（无法被Gα_o2缺失代偿）。小叶间Gα_o1/Gα_o2表达差异与突触及解剖效应的小叶特异性分布一致。研究首次在小脑体内明确区分Gα_o两剪接变体对小脑血管发育与突触形成的相反调控作用，确立Gα_o1为促进小脑发育与突触建立的主导亚基，为GNAO1脑病中小脑相关功能障碍的机制探索提供形态学与突触生物学基础。未来需进一步解析各亚型激活的下游信号通路差异。