基于机器学习和KEAP1–NRF2对接的耐应激微生物抗光老化肽整合识别

《Journal of Peptide Science》：Integrative Identification of Anti-Photoaging Peptides From Stress-Tolerant Microorganisms via Machine Learning and KEAP1–NRF2 Docking

　　

紫外线暴露产生的过量活性氧(reactive oxygen species, ROS)通过降解胶原并抑制其合成引发光老化。本研究提出了一种将γ辐照微生物的生物学应激响应与新型抗光老化肽发现相联系的综合性策略。研究人员对耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans)和新隐球菌(Cryptococcus neoformans)经辐射调控的转录组进行了分析，重点关注DNA修复和氧化应激响应。基于这些数据集，研究人员在计算机中生成肽库，进行生物化学性质筛选，并采用七分类器机器学习(machine learning, ML)算法进行优先级排序。利用Rosetta FlexPepDock针对KEAP1–NRF2口袋进行结构验证，鉴定出48个对接阳性序列。随后，研究人员合成了排名前21的肽并通过体外验证进行评估。其中，7种候选肽在200 μM浓度下抑制了胶原酶活性。在这些肽中，4种肽以剂量依赖性方式提高了紫外线B(ultraviolet B, UVB)诱导成纤维细胞中的前胶原I型C肽(procollagen type I C-peptide, PIP)水平。此外，这些肽显著提高了COL1A1 mRNA水平，同时降低了基质金属蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1, MMP1)和MMP9的转录本和蛋白质水平。总之，本研究提供了一种整合策略，将组学、机器学习和对接相结合以发现具有前景的肽候选物，并通过体外评估进行验证。该方法提供了有前景的抗光老化候选物，可应用于其他氧化应激通路和生物资源。

本研究聚焦于皮肤光老化这一重要的皮肤生物学问题。光老化主要由慢性紫外线辐射导致的活性氧(ROS)累积所引起，过量的ROS水平引发氧化应激，加速炎症信号传导，诱导细胞损伤，促进色素沉着，并导致衰老。在紫外线暴露的皮肤中，基质金属蛋白酶(MMP)表达增加，而I型胶原合成减少，导致结构完整性丧失和皱纹形成。因此，抑制胶原降解并恢复胶原合成的策略对于抗光老化效应至关重要。

短肽因其良好的安全性、可调节的理化性质、独特的靶向潜力以及配方灵活性而成为多种应用的有吸引力的候选物。尽管已有研究关注食物来源或生物体来源的生物活性肽，但大多数缺乏明确的作用机制。特别是利用内源性抗氧化信号如Kelch样ECH相关蛋白1(KEAP1)–核因子红细胞2相关因子2(NRF2)复合物进行肽的合理设计，在抗光老化肽的发现中尚未被探索。KEAP1–NRF2通路是调控细胞氧化应激响应的关键机制。在应激条件下，Nrf2从Keap1解离并转位至细胞核，触发抗氧化基因表达。因此，抑制Keap1与Nrf2结合或促进Nrf2激活的肽可能有助于修复氧化应激介导的细胞损伤。

适应极端环境的微生物具有独特的应激耐受性，特别是对辐射和氧化损伤的响应。耐辐射奇球菌以其辐射抗性而闻名，新隐球菌则以其对各种环境应激的适应性而著称。因此，针对这些微生物应激适应蛋白组的策略至关重要。

研究人员开发了将γ辐照微生物的生物学应激响应与抗光老化肽候选物识别相联系的整合工作流程。首先通过RNA测序(RNA-seq)分析转录组数据并确定辐射响应特征。这些蛋白质随后作为计算机肽生成的来源。接下来，通过顺序生物化学性质过滤和机器学习筛选进行候选肽优先级排序。为了建立结构基础，研究人员进行了KEAP1–NRF2口袋的分子对接。

研究结果表明，γ辐照显著调控了两种微生物的转录组。差异表达分析在新隐球菌中鉴定出1334个差异表达基因(DEG)，在耐辐射奇球菌中鉴定出371个DEG。功能富集分析显示，两种生物中均存在与辐射诱导损伤修复和缓解相关的共享机制，包括DNA损伤修复、蛋白酶体介导的降解蛋白修复、脂质转运和ATP酶活性等通路的显著上调。

在机器学习-based优先级排序中，研究人员从γ辐照蛋白质生成推定肽，然后应用两个步骤的筛选过程，包括生物化学性质（等电点、二级结构以及体外/体内聚集性）和ML训练。经过计算机消化和基于长度及生物化学性质的顺序过滤后，ML模型从新隐球菌中优先筛选出38,451个肽，从耐辐射奇球菌中优先筛选出46,809个肽。七种分类器包括Ada Boost分类器、CatBoost分类器、Extra Trees分类器、Gradient Boosting分类器、Light Gradient Boosting Machine、Random Forest分类器和Extreme Gradient Boosting。

在分子对接分析中，研究人员使用Rosetta FlexPepDock将候选肽对接到KEAP1的NRF2结合位点。以NRF2模型化的-8.07分为基准，平均对接分数<-8.07的肽被分类为对接阳性。在此标准下，新隐球菌贡献了31个肽（最佳分数-12.7），耐辐射奇球菌贡献了17个（-10.3）。共有48个短肽被优先确定为对接阳性候选物。其中排名前21的候选肽被选中进行化学合成和后续功能验证。

体外筛选显示，在21个候选肽中，仅有7个肽（肽60、63、66、67、69、72、77）在200 μM浓度下显著抑制胶原酶活性。在UVB暴露的CCD-986sk成纤维细胞中，肽60、63、66和67以剂量依赖性方式恢复PIP至与表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)处理对照组相似的水平。这些筛选数据表明，多种肽发挥包括降低胶原酶活性和恢复UVB挑战成纤维细胞中前胶原在内的复杂细胞外基质(ECM)保护效应。

在基因表达调控方面，UVB暴露增加了CCD-986sk成纤维细胞中MMP1和MMP9的mRNA水平，降低了COL1A1 mRNA水平，证实了UVB诱导的光老化。相反，四种选定肽（60、63、66和67）的处理以剂量依赖性方式逆转了这一效应。COL1A1转录本的表达得到恢复，而MMP1/MMP9相对于UVB组降低。ELISA检测进一步证实，UVB辐射显著增加了两种金属蛋白酶的分泌，而四种候选肽的处理以浓度依赖性方式降低了MMP1和MMP9水平。

在讨论部分，研究人员指出该研究建立了将γ辐照微生物的应激响应与具有抗氧化性质的短肽识别相联系的新工作流程。转录组分析显示了一致的应激响应程序增强，包括DNA修复、通过蛋白酶体通路的蛋白修复以及离子和能量稳态的维持。两步筛选过程评估了肽对皱纹形成的间接和直接影响。虽然这些肽在体外显示出比阳性对照EGCG更低的效力，但其安全性、加工便利性和靶向性使其成为有前景的优化和开发候选物。

该研究存在两个重要局限性：第一，实验验证有限，仅关注了UVB暴露成纤维细胞中的抗光老化效应，未涉及氧化应激可导致的其他损伤如炎症、衰老、组织损伤和色素沉着；第二，需要体内光老化模型来提高临床转化的可信度，并需要确认NRF2的核转位以提供KEAP1–NRF2复合物破坏的直接证据。

研究结论指出，本研究提出了一种将组学、机器学习和分子对接相结合的多方面策略，以促进抗氧化肽的系统发现和优先级排序。这种整合不仅可以应用于KEAP1，还可以应用于其他氧化应激通路和靶点，从而扩展机制应用范围并为先导候选物的合理优化提供平台。基于目前鉴定的肽（60、63、66和67），药物化学优化可以增强其稳定性、通透性和功效。与皮肤应用相关的配方和靶向递送的进一步研究，以及与较小分子抗氧化剂的协同效应测试，将有助于阐明其临床潜力。该研究旨在识别保留ECM并激活NRF2通路的新型抗光老化先导化合物。