调节性T细胞促进感觉神经元生长并对抗神经毒性

《Neurobiology of Pain》：Regulatory T cells promote sensory neuron growth and protect against neurotoxicity

　　

Tre教授

调节性T细胞（Tregs）维持免疫稳态并抑制炎症，新兴证据表明其亦能调节神经元功能和再生。背根神经节（DRG）感觉神经元传递疼痛信号，可被化疗药物如紫杉醇（PTX）损伤，导致神经病理性疼痛。尽管Tregs在神经病理性疼痛治疗中显示出前景，但Treg与神经元相互作用的机制尚不明确。研究人员利用体外共培养系统，检测了原代DRG神经元与Tregs的相互作用及其对PTX诱导神经毒性的影响。活细胞成像显示，活化Tregs增强神经突起长度和分支，并优先定位于神经元/神经突起富集区域。此外，活化Tregs挽救了PTX诱导的神经突起生长抑制。药理学阻断实验鉴定出Treg来源的双调蛋白（AREG）对神经突起生长至关重要，而AREG和神经肽Y（NPY）均为Treg介导的抗PTX神经毒性保护所必需。这些发现将Tregs鉴定为感觉神经元生长和抵御PTX神经毒性的直接促进者，并通过特定分子介质发挥作用，支持其在外周神经病理性疼痛中的潜在治疗价值。

# 调节性T细胞促进感觉神经元生长并保护其免受紫杉醇神经毒性

## 研究背景与问题提出

调节性T细胞（Tregs）是CD4⁺ T细胞的一个特殊亚群，在抑制炎症、调控固有免疫和适应性免疫以及维持免疫稳态方面发挥核心作用。传统上，Tregs通过细胞因子分泌、代谢调节和接触依赖性机制抑制过度免疫激活，从而防止自身免疫反应，同时支持组织修复。然而，近年来越来越多的证据表明，Tregs还具有神经调节功能，包括促进髓鞘再生、增强脊髓损伤修复以及调节外周感觉神经元活动等。

背根神经节（DRG）感觉神经元是将外周感觉输入传递至中枢神经系统（CNS）的关键结构。这些神经元易受到外周神经损伤（PNI）或化疗药物如紫杉醇（PTX）的损伤，导致外周神经病理性疼痛。PTX作为一种广泛应用的微管稳定剂类化疗药物，可沿感觉神经累积，损伤轴突末梢和DRG细胞体，引发"回缩性退化"。值得注意的是，无论是PNI还是PTX诱导的周围神经病变，均与促炎免疫细胞浸润增加和抗炎细胞（如Tregs）减少相关，导致持续性神经炎症和神经元过度兴奋，维持痛觉超敏状态。尽管既往研究已通过CD28超激动剂、肿瘤坏死因子受体2（TNFR2）激动剂、鞘内低剂量白细胞介素-2（IL-2）或Treg过继转移等方式增强Treg群体，观察到对神经病理性疼痛行为的缓解作用，但Tregs对DRG感觉神经元的直接效应仍有待深入探索。

本研究旨在直接探究Tregs对DRG感觉神经元的体外效应，具体包括：（1）Tregs与DRG神经元的相互作用特征；（2）Treg处理是否能缓解PTX诱导的神经突起生长抑制；（3）Treg来源的促再生因子AREG和NPY在这一过程中的作用机制。

## 主要技术方法

本研究所用的主要关键技术方法包括：从DEREG转基因小鼠（表达Foxp3启动子驱动的白喉毒素受体-增强绿色荧光蛋白融合蛋白）通过荧光激活细胞分选（FACS）分离GFP⁺ Tregs；利用抗CD3/CD28磁珠联合重组IL-2体外活化Tregs；从C57BL/6J小鼠解剖DRG并进行酶解（胶原酶、胰蛋白酶-EDTA）和Percoll密度梯度离心获得原代DRG感觉神经元；采用ZEISS Lattice Lightsheet 7显微镜进行高分辨率活细胞成像（每20分钟或每2小时采集一次，持续24小时）；通过NeuroLucida 360软件进行神经元三维重构和定量分析；利用免疫荧光染色（β-III微管蛋白）结合ZEISS LSM 710共聚焦显微镜进行固定细胞成像分析；以及通过药理学阻断（EGFR拮抗剂AG1478、NPY1受体拮抗剂BIBO3304）探究分子机制。

## 研究结果

### 3.1 调节性T细胞增强DRG感觉神经元神经突起生长，但不影响胞体形态

为探究Tregs对神经元生长的影响，研究人员将DRG感觉神经元与活化Tregs（体外以抗CD3/CD28和IL-2刺激）或静息Tregs共培养，并通过ZEISS Lattice Lightsheet 7显微镜进行24小时活细胞成像。结果显示，培养条件对DRG感觉神经元的平均神经突起长度（F(2,137)=5.300, p=0.0061）和节点数量（F(2,175)=3.900, p=0.0220）具有显著主效应。事后比较表明，与静息Tregs相比，活化Treg共培养组在16小时时表现出更大的总神经突起长度（p=0.0062）和更多的节点数量（p=0.0049）。效应量分析显示，活化Treg共培养在多个时间点对总神经突起长度、平均神经突起长度、复杂性和节点数均产生中等效应量（0.5
### 3.2 活化Tregs与DRG感觉神经元之间存在双向吸引

为评估Tregs向DRG神经元的趋向性，研究人员在共培养体系中定量分析了Treg密度。混合效应分析显示，时间（F(2,43)=30.99, p<0.0001）和象限条件（F(3,32)=33.02, p<0.0001）对Treg密度有显著主效应。在活化Treg+神经元共培养中，Treg密度在神经突起含区域显著高于无神经突起区域（8小时：p=0.0013；12-16小时：p=0.0020）。进一步分析16小时时Treg与神经突起末梢的关联性发现，活化Treg共培养中Treg与神经末梢的关联显著高于静息Treg共培养（t(7)=6.783, p=0.0003），且该关联强度不能仅由Treg增殖解释（r²=0.2965, p=0.1295）。这些结果表明活化Tregs被强烈吸引至DRG感觉神经元末梢，且这种关联可能由定向细胞相互作用而非单纯增殖驱动。

### 3.3 紫杉醇快速抑制DRG感觉神经元多参数神经突起生长

利用活细胞成像实时追踪PTX对DRG神经突起生长的动态影响，研究人员发现PTX处理组与对照组相比，总神经突起长度（F(1,10)=31.91, p=0.0002）、平均神经突起长度（F(1,10)=17.75, p=0.0018）、复杂性（F(1,10)=6.096, p=0.0332）、节点数量（F(1,10)=10.75, p=0.0083）和末梢数量（F(1,10)=14.14, p=0.0037）均显著降低，且存在显著的时间×处理交互作用。多重比较显示，PTX处理后200分钟即可观察到总神经突起长度的显著降低（p=0.0343），并持续至800分钟（p=0.0012）。

### 3.4 Tregs保护DRG感觉神经元免受紫杉醇诱导的神经突起生长抑制

在PTX（1 μM）处理后，DRG神经元与活化Tregs共培养12小时。单向方差分析显示处理条件对神经突起生长有显著影响（F(2.545,12.72)=11.29, p=0.0009）。PTX单独处理显著降低神经突起生长（p=0.0415），而与Tregs共培养显著挽救了PTX诱导的生长抑制（p=0.0178），恢复至与vehicle处理组相当的水平（p=0.9370）。

### 3.5 AG1478阻断Tregs的促神经突起生长效应，而AG1478和BIBO3304均抑制Treg介导的神经保护作用

为探究AREG和NPY在Treg效应中的作用，研究人员使用EGFR拮抗剂AG1478和NPY1受体拮抗剂BIBO3304进行药理学阻断。结果显示，AG1478呈剂量依赖性降低Treg共培养中的神经突起生长（F(3,8)=3.715, p=0.0202），1 μM时达到显著性（adj. p=0.0174）；而BIBO3304对Treg的促生长效应无显著影响。在PTX处理模型中，单向方差分析显示处理条件有显著效应（F(7,30)=4.056, p=0.0031）。AG1478（adj. p=0.0490, g=-1.16）和BIBO3304（adj. p=0.0449, g=-1.66）均显著阻断了Treg介导的神经保护作用，且效应量达到大或极大。这些结果表明AREG和NPY均参与Treg介导的PTX神经毒性保护。

## 讨论与结论

本研究的主要结论为：Tregs直接与DRG感觉神经元相互作用，促进神经突起生长并保护其免受PTX神经毒性，可能通过AREG和NPY等介质实现。这些发现鉴定了一种此前未被认识的神经免疫相互作用，可能有助于感觉神经元的修复和保护。

研究人员指出，尽管直接Treg-神经元信号可能仅代表体内调控神经元损伤和恢复的复杂细胞和分子机制的一个组成部分，但本研究基于雌性DRG神经元体外培养的观察为后续研究奠定了基础。未来研究应确定Tregs或其介质是否能够在体内促进化疗后或其他形式神经损伤后的感觉神经元恢复和保护，并应在雄性中评估这些机制以确定Treg介导的神经保护是否存在性别依赖性差异。

本研究存在一定的局限性：首先，研究完全依赖体外模型，未能完全捕捉PTX在体内的全身性和累积性暴露特征；其次，虽然鉴定出AREG和NPY作为候选介质，但未直接定量检测共培养条件下Tregs分泌这些因子的水平和动力学；第三，神经元和Tregs均来源于雌性小鼠，其在雄性中的普适性尚不清楚。尽管如此，该研究为理解Treg-感觉神经元直接相互作用及其分子机制提供了重要见解，支持Tregs作为外周神经病理性疼痛潜在治疗靶点的价值。