头孢他啶-阿维巴坦(Ceftazidime-Avibactam, CAZ-AVI)诱导的KPC变异体(KPC-25/KPC-127)在颅内感染中的出现及其临床诊治意义

《MicrobiologyOpen》：Emergence of Ceftazidime-Avibactam-Induced KPC Variants (KPC-25/127) in Intracranial Infection and Implications for Clinical Management

　　

摘要：新型肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae carbapenemase, KPC)变异体导致临床治疗失败的出现对公共卫生构成重大威胁。为指导携带KPC变异体的肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, K. pneumoniae)所致感染的临床诊治，本研究报道了1例患者在头孢他啶-阿维巴坦(CAZ-AVI)治疗期间，耐CAZ-AVI的KPC变异体产K. pneumoniae(CRKP)在单例患者中的复杂进化轨迹。研究人员从接受亚胺培南序贯CAZ-AVI治疗的K. pneumoniae感染患者体内获得3株产KPC的K. pneumoniae(KPC-KP)分离株：含blaKPC-2的K2株表现碳青霉烯类耐药；经12 d CAZ-AVI给药后，分离到含blaKPC-25的K25株，表现CAZ-AVI耐药但对亚胺培南敏感；而联合CAZ-AVI与亚胺培南治疗后分离的含blaKPC-127（首次由本课题组鉴定）的K127株，则表现对CAZ-AVI与碳青霉烯类的双重耐药，该碳青霉烯类耐药归因于外膜蛋白突变合并blaKPC-127过表达。基因区域分析显示所有亚型均位于保守遗传背景IS26-ISKpn8-blaKPC-ΔISKpn6-ΔtnpR-Tn1721内。KPC变异体的克隆、异源表达及酶动力学分析和最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)测定证实变异体改变了CAZ-AVI及碳青霉烯类的MIC。与KPC-2蛋白相比，两变异体蛋白对头孢他啶的水解活性均降低，且阿维巴坦(Avibactam)对KPC变异体的半数抑制浓度(Half Maximal Inhibitory Concentration, IC50)显著高于野生型KPC-2蛋白。结果表明KPC变异体蛋白与阿维巴坦亲和力低，从而降低了对该抑制剂的敏感性。

论文解读：头孢他啶-阿维巴坦诱导KPC变异体(KPC-25/KPC-127)在颅内感染中的出现及临床意义

碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)的全球播散是临床抗感染治疗的严峻挑战，产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(Klebsiella pneumoniae Carbapenemase, KPC)是其首要耐药机制。头孢他啶-阿维巴坦(Ceftazidime-Avibactam, CAZ-AVI)作为β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂(BL/BLI)组合是治疗KPC产K. pneumoniae(KPC-KP)的一线药物，但自2015年FDA批准以来，治疗中已出现CAZ-AVI耐药KPC-KP，多由原型bla_KPC-2或bla_KPC-3突变产生新KPC变异体所致。KPC变异体因Ω-loop等活性中心周围环区氨基酸突变改变酶结构与阿维巴坦(Avibactam)亲和力，可导致CAZ-AVI治疗失败；部分变异体可恢复碳青霉烯敏感性，但缺乏统一诊治规范。此外，颅内感染部位因血脑屏障(Blood-Brain Barrier, BBB)限制药物渗透，易形成亚抑制浓度(sub-inhibitory concentration)，可能加速bla_KPC突变，但该场景下KPC变异体体内进化轨迹尚不明晰。本研究以西安交通大学第二附属医院1例颅内感染患者在亚胺培南序贯CAZ-AVI治疗中连续分离到3株同系KPC-KP（分别携带bla_KPC-2、bla_KPC-25、首报bla_KPC-127）为对象，综合运用微生物药敏试验、全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)、质粒及孔蛋白分析、KPC酶克隆表达与稳态动力学测定，阐明CAZ-AVI压力下KPC-2向KPC-25及KPC-127的体内进化机制、变异体对β-内酰胺及阿维巴坦的亲和性变化，以及外膜孔蛋白突变在双重耐药表型中的作用，指出准确鉴定KPC变异体结合药敏、碳青霉烯酶表型及WGS对及时调整抗菌方案和改善预后的价值。该论文发表于《MicrobiologyOpen》。

研究人员收集同一颅内感染患者经亚胺培南及CAZ-AVI序贯治疗不同时点分离的3株KPC-KP临床分离株(K2、K25、K127)，采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行菌种鉴定，肉汤微量稀释法测定抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)并以CLSI/EUCAST/FDA标准判读，NG-Test CARBA5及碳青霉烯酶抑制增强试验检测碳青霉烯酶表型；设计特异性引物PCR扩增bla_KPC-2样基因并克隆至pHSG398及pET28a载体转化E. coli DH5α/BL21进行异源表达；对菌株进行Illumina二代联合Oxford Nanopore三代ONT测序，用Unicycler混合组装，RAST、MLST、PlasmidFinder、ResFinder进行基因组注释与MLST分型、质粒复制子及耐药基因预测，BacWGSTdb做SNP分析，Proksee与Chiplot绘制质粒图谱及bla_KPC遗传环境；超声破碎与Ni柱亲和层析、Superdex 75凝胶过滤纯化重组KPC-2/KPC-25/KPC-127蛋白，SDS-PAGE验证纯度；以紫外分光光度法测定酶对亚胺培南、美罗培南、头孢他啶的水解初速率计算稳态动力学参数(K_cat、K_m、K_cat/K_m)，以硝基cefin为报告底物测定阿维巴坦对各KPC酶的IC₅₀。

3.1 Case Information（病例信息）

一名45岁女性颅内感染患者初始痰标本分离到K2（bla_KPC-2，碳青霉烯耐药），换用CAZ-AVI(2.5 g Q12h)治疗11 d后感染未控，分离到K25（bla_KPC-25，CAZ-AVI耐药、亚胺培南敏感），再调整为美罗培南联合CAZ-AVI治疗≤5 d内痰中分离到K127（bla_KPC-127，CAZ-AVI与美罗培南双重耐药），最终改用CAZ-AVI(2.5 g q8h)联合氨曲南(Aztreonam)后临床治愈。证实同一患者体内在CAZ-AVI选择性压力下发生了bla_KPC-2→bla_KPC-25→bla_KPC-127的序贯进化。

3.2 Antimicrobial Susceptibility Profiles of K. pneumoniae Clinical Isolate, Transformant, and Recipient to Antimicrobial Agents（肺炎克雷伯菌临床株、转化子及受体株的药敏谱）

临床株与转化子药敏显示：KPC-25表达使CAZ-AVI MIC升高64倍但不影响碳青霉烯MIC；KPC-127表达使CAZ-AVI MIC升高256倍，并使亚胺培南MIC升高4倍、美罗培南MIC升高2倍。KPC-25完全丧失碳青霉烯水解能力，KPC-127保留部分碳青霉烯水解能力。克隆实验证实KPC变异体本身介导了CAZ-AVI及碳青霉烯MIC的显著改变。

3.3 Molecular Analysis of K. pneumoniae Isolates Harboring bla_KPCVariants（携带bla_KPC变异体肺炎克雷伯菌分离株的分子分析）

WGS示三株均为ST11型(Sequence Type 11)，K25较KPC-2在Ω-loop区有167_168dupLE插入，K127在此基础上另有172 A>T点突变；SNP分析示三株高度同源。三株均携带染色体aadA2、bla_SHV-182及质粒bla_CTX-M-65、bla_KPC(变异型)、bla_SHV-12、bla_TEM-1B。OmpK35在三株中均因插入致移码突变失活；K2与K25 OmpK36为野生型，K127 OmpK36有GD插入突变。bla_KPC均位于IS26-ISKpn8-bla_KPC-ΔISKpn6-ΔtnpR-Tn1721保守遗传骨架中，属IS26截断Tn1721的非Tn4401型转座元件。

3.4 Virulence Factors of K. pneumoniae（肺炎克雷伯菌毒力因子）

三株均为荚膜血清型K47，均携带~190 kb IncHI1B(K)/FIB不相容群毒力质粒（与pKP58-1同源性≥95%），含重金属（铜、银）耐药基因及毒力因子调控基因rmpA2和气杆菌素(Aerobactin)铁摄取系统基因iucABCD-iutA，提示菌株兼具耐药与高毒力特征。

3.5 Functional Characterization of KPC-2, KPC-25, and KPC-127（KPC-2、KPC-25及KPC-127的功能表征）

纯化酶动力学显示：KPC-25与KPC-127对亚胺培南、美罗培南催化效率(K_cat/K_m)较KPC-2大幅降低（分别降至约1/78、1/47和1/10、1/7），对头孢他啶水解活性亦下降；阿维巴坦对KPC-25、KPC-127的IC₅₀（分别为0.11 μM、0.17 μM）显著高于KPC-2（0.023 μM），表明变异体与阿维巴坦结合亲和力降低，逃逸抑制后保留足够头孢他啶催化活性，共同介导CAZ-AVI耐药表型。K127额外172 A>T突变部分抵消167_168dupLE插入所致的碳青霉烯敏感性恢复，并提高CAZ-AVI耐药水平。

讨论与结论总结

中国ST11型bla_KPC-2阳性CRKP为主要流行克隆，CAZ-AVI使用是bla_KPC突变主要风险因素。本案例感染部位为颅内，BBB致局部CAZ-AVI亚抑制浓度可能是KPC-25/KPC-127快速进化的促因，提示标准CAZ-AVI剂量(2.5 g Q12h)对颅内感染可能不足，建议在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring, TDM)指导下提高剂量（如2.5 g Q6h）以保证感染部位有效暴露。分子机制上，KPC-25(167_168dupLE)与KPC-127(167_168dupLE+172 A>T)均为Ω-loop区突变，使阿维巴坦IC₅₀升高、亲和力下降，同时碳青霉烯水解能力差异化丧失（KPC-25完全丧失、KPC-127部分保留），172 A>T使KPC-127较KPC-25 CAZ-AVI耐药水平更高且部分恢复碳青霉烯水解。bla_KPC位于IS26截断Tn1721中转座子，IS26介导水平基因转移促进变异体播散。三株共携带毒力质粒增强适应性与不良预后。KPC变异体可致常规碳青霉烯酶检测（mCIM/eCIM、免疫层析）假阴性及自动化药敏系统误判为ESBL产株；虽KPC-25对碳青霉烯复敏，但碳青霉烯单药可筛选回复KPC-2型耐药，不推荐单独使用；本例CAZ-AVI(2.5 g q8h)联合氨曲南挽救治疗成功，为此类感染提供参考。需建立KPC变异体全球监测网，将WGS整合入重症CRKP感染诊断，TDM指导CAZ-AVI个体化给药以降低变异体发生风险。研究人员得出结论：在CAZ-AVI治疗期间，颅内感染患者体内序贯出现了KPC-25与首报KPC-127变异体，BBB导致的感染部位药物亚抑制浓度驱动了bla_KPC突变；KPC-25与KPC-127因Ω-loop插入及点突变降低与阿维巴坦亲和力并差异化改变碳青霉烯水解活性，K127双重耐药还与OmpK36突变及bla_KPC-127过表达有关；准确鉴定KPC变异体并结合TDM调整方案及联合治疗是应对此类新兴威胁的关键。