《Molecular Genetics & Genomic Medicine》：Novel DMD Frameshift Variant (p.Leu2017Profs*5) in Spectrin-Like Repeat 16 Expands the Mutational Spectrum of DMD
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杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种X连锁神经肌肉疾病，由DMD基因的致病性变异引起。该基因编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin），这是一种细胞骨架蛋白，通过抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合物（dystrophi
杜氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是一种X连锁神经肌肉疾病，由DMD基因的致病性变异引起。该基因编码抗肌萎缩蛋白（dystrophin），这是一种细胞骨架蛋白，通过抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合物（dystrophin-associated protein complex, DAPC）将细胞内肌动蛋白与细胞外基质相连接，从而维持肌纤维的完整性。随着疾病修饰疗法（disease-modifying therapies）的出现，早期和准确的分子诊断日益重要。全外显子组测序（whole-exome sequencing, WES）被广泛用于评估原因不明的肌酸激酶（creatine kinase, CK）升高，并将DMD与其他遗传性神经肌肉疾病相鉴别。
WES在一名台湾男孩中鉴定出DMD基因的新型半合子移码变异（NM_004006.3:c.6050_6051del; p.Leu2017Profs*5），该患儿CK水平显著升高（>10,000 U/L），临床表现与DMD一致。根据ACMG（American College of Medical Genetics and Genomics）标准（PVS1, PS2, PP3），该变异被分类为可能致病。比较基因组学分析显示该变异位点在第16个血影蛋白样重复区（外显子42）具有强烈的进化保守性，phastCons评分为1，phyloP评分分别为+2.925和+1.015。基于AlphaFold的结构建模提示三螺旋束结构（three-helix bundle architecture）遭到破坏，而基于CHARMM（Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics）的能量分析提示存在潜在的 destabilizing效应，这一模式与既往报道的致病性外显子42移码变异更为一致，而非同一位点的良性错义变异。
这是首例与新型移码变异c.6050_6051del（p.Leu2017Profs*5）相关的DMD病例报告。整合基因组学、进化论和结构分析支持该变异为可能致病的解读。该研究拓展了DMD的突变谱，并强调了将WES与结构信息引导的方法相结合用于变异解读的价值。这些发现为所鉴定变异的潜在效应提供了初步的结构见解，并强调了在缺乏功能学检测时，结构信息引导的变异解读可能具有的应用前景。
研究背景与问题提出
杜氏肌营养不良症（DMD）是一种X连锁神经肌肉疾病，以进行性肌无力和显著高CK血症为特征，由DMD基因突变所致。该基因编码的抗肌萎缩蛋白是一种大型细胞骨架蛋白，通过抗肌萎缩蛋白相关蛋白复合物（DAPC）将细胞内肌动蛋白与细胞外基质相连接，在肌肉收缩过程中提供机械稳定性。由于基因庞大，DMD基因表现出高度的等位基因异质性：缺失约占60%–70%，点突变或小核苷酸替换约占20%–25%，重复约占10%–15%，其他重排约占2%。这些改变以多种方式破坏抗肌萎缩蛋白阅读框，可能导致无义介导的mRNA降解、截短的不稳定蛋白或功能降低的变异体。
尽管许多DMD缺失已被收录于公共数据库，但新鉴定变异常缺失于这些资源。因此，仅基于临床特征对症状性个体进行新型变异的临床解读仍具挑战性。功能性验证研究在单病例场景中常因患者材料有限、伦理考量以及建立疾病相关实验模型所需的时间和成本而难以实施。因此，互补性计算方法越来越多地被用于支持变异解读。移码突变可能导致蛋白质构象改变，这可通过AlphaFold进行建模；此外，计算机辅助自由能计算可用于评估此类变异对蛋白质结构稳定性的潜在影响，为致病性变异解读提供支持性证据。
病例特征与诊断挑战
本研究描述一名散发性6岁男孩，通过全外显子组测序（WES）发现其携带DMD基因外显子42中的新型半合子移码缺失（c.6050_6051del; p.Leu2017Profs*5）。该变异在ClinVar中缺席，根据ACMG/AMP指南被分类为可能致病。患儿因不明原因肌张力低下、轻度大运动发育迟缓、注意缺陷多动障碍（ADHD）和孤独症特征接受康复治疗，最初因腹部不适和间歇性胸痛就诊急诊科。实验室检查显示CK显著升高（19,061 U/L），AST 265 U/L，ALT 569 U/L，LDH 1164 U/L。神经系统检查显示Gowers征阳性、轻度腰椎前凸、摇摆步态及宽基底步态，可单足站立但不能跳跃。NSAA（North Star Ambulatory Assessment）评分为26/34，提示保留行走能力但高需求运动任务已出现限制。
关键技术方法
本研究纳入来自台湾的一个非近亲结婚家庭的三名成员（先证者及其父母）。研究团队采用以下主要技术方法：首先，对先证者进行全外显子组测序（WES），测序读数比对至GRCh38/hg38参考基因组，使用Illumina DRAGEN（4.2.6版）端到端变异 calling流程；通过Sanger测序确认变异为新发（de novo）变异。其次，进行跨物种比较基因组学分析，使用UCSC Genome Browser 100脊椎动物比对轨迹评估进化保守性，并以phastCons和phyloP量化保守程度。第三，基于AlphaFold蛋白质结构数据库获取人源抗肌萎缩蛋白结构模型（残基Val1401–Leu2800），利用Biovia Discovery Studio 2024构建移码变异体模型，通过结构叠加比较野生型与突变体差异。第四，采用CHARMM力场进行自由能计算，评估变异对蛋白质结构稳定性的影响，并与LOVD（Leiden Open Variation Database）中已知的致病性移码变异（p.Glu2003Asnfs*19和p.Glu2013Ilefs*11）及良性错义变异（p.Leu2017Ile和p.Asn2019Ser）进行比较。
研究结果
临床病程与变异鉴定
先证者为6岁男孩，具有不明原因肌张力低下、轻度大运动发育迟缓、ADHD和孤独症特质病史。WES鉴定出DMD基因新型半合子移码变异（chrX:32,310,147; NM_004006.3:c.6050_6051del; p.Leu2017Profs*5），该变异引入提前终止密码子，预测导致功能丧失。Sanger测序证实该变异为先证者新发变异，其母亲未检测到，符合ACMG的PS2证据级别。该变异在ClinVar、台湾生物银行及gnomAD（Genome Aggregation Database）中均缺席，位于编码抗肌萎缩蛋白中央杆状域第16个血影蛋白样重复区的外显子42。基于ACMG/AMP标准（PVS1, PS2），该变异被分类为可能致病。
进化保守性分析支持变异的功能相关性
使用IGV（Integrative Genomics Viewer）对下一代测序数据进行可视化确认，该位点平均测序深度超过30×。跨物种比较分析显示变异位点具有强烈的进化保守性：缺失核苷酸的phastCons评分为1，phyloP评分分别为+2.925和+1.015，提示进化约束。九种脊椎动物（从黑猩猩到蜥蜴）的多序列比对显示该区部分保守，但鸟类中未观察到此模式，且UCSC Genome Browser中缺乏鱼类序列限制了全面评估。
结构建模与自由能计算提示突变体抗肌萎缩蛋白发生去稳定化
AlphaFold模型分析显示，突变体在C末端发生残基改变和提前截短。野生型与突变体模型的结构叠加显示，突变体较难维持野生型中观察到的血影蛋白样重复区特征性三螺旋束结构，提示结构完整性受到破坏。该区域pLDDT（predicted local distance difference test）评分为92.52，IUPred2A内在无序性预测显示低无序概率（0.13），表明该区结构有序而非内在无序。CHARMM力场计算显示，Leu2017Profs*5变异的相对去稳定化模式与既往报道的致病性移码变异（p.Glu2003Asnfs*19和p.Glu2013Ilefs*11）相似，而良性错义变异（p.Leu2017Ile和p.Asn2019Ser）相对于野生型结构的能量变化极小。
讨论与结论
研究人员强调了几方面的关键见解。首先，该病例凸显了DMD在新生儿筛查项目实施前的诊断挑战：台湾于2022年1月启动基于CK-MM的干血斑筛查，但该患儿出生于此之前，未能受益于早期检测。其次，该病例说明共患神经发育状况可能掩盖神经肌肉疾病的早期表现——肌张力低下和运动发育迟缓可能与孤独症谱系障碍共存，而ADHD相关的执行功能障碍、感觉处理差异和运动协调缺陷可能降低体力活动，从而潜在掩盖 underlying 肌无力。该患儿NSAA评分26/34表明其处于DMD早期可行走阶段，这是关键治疗窗口期；在此阶段启动糖皮质激素治疗可改善运动功能轨迹并延迟丧失行走能力。
从分子角度，该研究支持结构信息引导变异解读的效用。该变异定位于中央杆状域第16个血影蛋白样重复区，该区域作为弹性间隔区和机械缓冲器在肌肉收缩中发挥作用。AlphaFold结构建模和自由能分析提示，p.Leu2017Profs*5移码破坏了三螺旋束结构，并产生与既往致病性外显子42变异相似的去稳定化模式。然而，研究人员也指出这些结果需谨慎解读：计算机结构预测无法完全捕捉抗肌萎缩蛋白功能的复杂细胞和生物力学 context；AlphaFold对移码截断蛋白的预测可靠性尚未完全验证；静态能量计算可能无法完全反映体内构象动态；且缺乏肌肉活检、抗肌萎缩蛋白定量或蛋白质免疫印迹（western blot）分析的实验验证。
最终研究结论部分指出，整合基因组学和计算分析为该变异的可能致病性解读和潜在功能影响提供了支持性证据。该报告拓展了DMD的突变谱，并强调了结构信息引导方法作为变异解读互补工具的潜在作用。
