甘蔗梢腐病病原菌(Fusarium sacchari)14-3-3蛋白FsBmh1通过扣押新型激发子FsEcm33以逃避宿主免疫

《Molecular Plant Pathology》：Fusarium sacchari 14-3-3 Protein FsBmh1 Sequesters a Novel Elicitor FsEcm33 to Evade Host Immunity

　　

甘蔗梢腐病病原菌(Fusarium sacchari)是引起甘蔗梢腐病(PBD)的全球性毁灭性病原菌，造成重大经济损失。感染过程中，该真菌利用激发子诱导植物组织坏死，从而增强病原菌适应性。然而，F. sacchari中的关键激发子及其被植物识别的机制尚不清楚。研究人员鉴定了一种预测的糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白FsEcm33作为激活植物免疫的激发子。FsEcm33在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)质外体中被受体样蛋白NbRE02识别，并以需要共受体NbBAK1和NbSOBIR1的方式诱导细胞死亡。纯化的FsEcm33在本氏烟草中触发基础免疫反应，并增强多种植物物种（包括甘蔗、水稻、小麦和八角）的病害抗性。在F. sacchari中，FsEcm33定位于细胞表面，其被宿主识别限制了病原菌定殖。值得注意的是，FsEcm33特异性地与14-3-3蛋白FsBmh1相互作用，FsBmh1减少了其在真菌细胞表面的累积，提示了一种空间扣押机制帮助F. sacchari逃避宿主免疫。这些发现共同确立了FsEcm33作为一种被NbRE02感知的细胞表面激发子，并揭示了F. sacchari中FsBmh1扣押FsEcm33以逃避宿主识别和促进感染的进化策略。

甘蔗作为全球最重要的糖料和生物能源作物，长期受到梢腐病(PBD)的严重威胁。该病害由空气传播的真菌Fusarium sacchari引起，通过风雨传播侵染甘蔗心叶，导致叶片黄化、皱缩、扭曲，严重时造成心叶腐烂梢部腐烂，显著降低产量和品质。尽管前人已在病原体鉴定、种质抗性、环境因子及效应因子等方面开展了大量研究，但F. sacchari与宿主互作中的许多机制仍有待阐明。植物面临多种病原菌的持续攻击， timely sensing of potential pathogens is crucial for effective immune activation. 植物免疫的第一道防线利用细胞表面定位的模式识别受体(PRRs)识别pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)，触发先天免疫反应并限制病原菌感染。已知的PAMPs包括细菌鞭毛蛋白(flagellin，被FLS2识别)、真菌几丁质(chitin，被RLK1识别)及卵菌elicitin PiINF1(被ELR识别)等。PRRs识别PAMPs后，与共受体如BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-associated receptor kinase 1 (BAK1)和suppressor of BIR1-1 (SOBIR1)形成复合体，触发活性氧(ROS)爆发、胼胝质沉积及防御相关基因表达等下游免疫反应。

糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白(GPI-APs)作为重要的真菌表面蛋白，参与细胞壁生物合成、解毒和毒力调控。近年来，多种GPI-APs被报道可作为激发子触发植物免疫反应，但其对应的PRRs和识别机制尚不清楚。Ecm33是典型的GPI-AP，定位于细胞表面，在真菌中高度保守，对维持细胞壁完整性至关重要。在酵母中，Ecm33缺失导致细胞壁弱化、细胞体积增大和聚集以及增殖延迟；在人类病原菌白色念珠菌(Candida albicans)中，Ecm33缺失突变体表现出细胞壁再生受损、寿命缩短及无法形成生物膜等多重表型缺陷；在曲霉属真菌中，Ecm33的破坏导致严重的形态发生缺陷。在植物病原菌如构巢曲霉(A. nidulans)和尖孢镰刀菌(F. oxysporum)中，Ecm33的缺失导致生长受损、对刚果红敏感及毒力降低。然而，Ecm33在F. sacchari及宿主-病原菌互作中的作用尚不清楚。在此背景下，研究人员开展了本项研究，旨在鉴定F. sacchari中的新型激发子并解析其逃避宿主免疫的机制，论文发表于《Molecular Plant Pathology》。

研究人员综合运用了生物信息学分析、酵母信号序列捕获、亚细胞定位分析、病毒诱导基因沉默(VIGS)、双分子荧光互补(BiFC)、酵母双杂交、pull-down、蛋白质表达纯化、病原菌遗传改造(基因敲除、回补和过表达)、植物抗病性测定、组织化学染色及分子生物学检测等技术方法。研究样本队列来源于：本氏烟草(Nicotiana benthamiana)用于激发子活性检测和免疫机制研究；甘蔗品种ZZ9 (Saccharinum officinarum)、水稻、小麦和八角用于广谱抗性评价。

FsEcm33是一种特异性存在于子囊菌门的分泌型GPI-AP。生物信息学分析显示，FsEcm33(PZ436273)由1197 bp编码序列编码398个氨基酸残基，预测含有N端信号肽(SP)和C端GPI锚定序列，ω位点为D³⁷⁴，预测分子量为42.3 kDa，Phyre2预测其与最匹配结构的结构置信度为88%，为单体蛋白。系统发育分析表明FsEcm33广泛分布于子囊菌门(Asco mycota)。通过酵母信号陷阱实验验证，FsEcm33的信号肽能够引导酵母转化酶分泌，证实其为分泌蛋白。

FsEcm33靶向质外体并在NbBAK1和NbSOBIR1依赖下诱导本氏烟草细胞死亡。研究人员通过农杆菌介导的瞬时表达发现FsEcm33能够诱导细胞死亡，而去信号肽的FsEcm33ΔSP诱导细胞死亡的时间更晚、程度更轻。亚细胞定位显示FsEcm33-GFP定位于细胞壁和质外体区域，而FsEcm33ΔSP-GFP则不能，表明信号肽引导FsEcm33进入质外体对其发挥激发子功能至关重要。由于BAK1和SOBIR1是PRRs的重要共受体，研究人员通过VIGS沉默NbBAK1或NbSOBIR1后，发现FsEcm33无法诱导细胞死亡，而对照INF1亦然，说明FsEcm33诱导的细胞死亡依赖于NbBAK1和NbSOBIR1。

FsEcm33在本氏烟草中被NbRE02识别。研究人员通过BiFC实验发现FsEcm33与NbRE02在本氏烟草叶片中存在直接互作，黄色荧光信号仅在共表达FsEcm33-NYFP和NbRE02-CYFP时出现。进一步通过VIGS沉默NbRE02后，FsEcm33诱导的细胞死亡几乎被完全抑制，而INF1诱导的细胞死亡不受影响，表明NbRE02特异性识别FsEcm33并介导其诱导的细胞死亡。

FsEcm33作为激发子激活植物免疫反应。研究人员在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达了组氨酸标签(His)融合的FsEcm33蛋白，经Ni-NTA纯化后浓度达0.341 mg/mL。将纯化的FsEcm33-His蛋白浸润本氏烟草叶片后，2天即可观察到坏死症状，48小时检测到显著的ROS积累。与Flg22类似，FsEcm33快速且瞬时地诱导ROS爆发，且反应更早。防御相关基因分析显示，水杨酸(SA)通路标志基因NbPR2和茉莉酸(JA)通路标志基因NbLox均显著上调，PAMP触发免疫(PTI)标志基因NbHSR203J及超敏反应(HR)标志基因NbHIN1也上调表达，证实FsEcm33作为激发子激活植物免疫反应。

FsEcm33增强多种植物的病害抗性。用20 μg/mL FsEcm33-His预处理本氏烟草叶片24小时后接种灰葡萄孢(Botrytis cinerea)，病斑面积减少98.58%。该蛋白还增强了水稻对稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、小麦对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、八角对炭疽病菌(Colletotrichum horii)以及甘蔗对F. sacchari的抗性。处理后，水稻病斑数显著减少，小麦胚芽鞘病斑面积减少68%，甘蔗梢腐病和八角炭疽病的病情指数(DSI)分别降低71.26%和88.6%，表明FsEcm33能诱导植物广谱抗性。

FsEcm33负向影响F. sacchari的毒力。RT-qPCR分析显示FsEcm33在感染早期高表达，48 hpi达到峰值，是对应分生孢子中表达量的16倍以上。研究人员构建了FsEcm33基因缺失突变体ΔFsEcm33、回补株C-ΔFsEcm33和过表达株O-FsEcm33。接种甘蔗后发现，ΔFsEcm33导致更严重的梢腐病症状和更高的DSI，而O-FsEcm33则显著减轻症状。通过苯胺蓝染色追踪定殖过程，ΔFsEcm33的定殖速率显著加快，O-FsEcm33定殖最慢。DAB染色显示O-FsEcm33感染部位ROS积累显著，而ΔFsEcm33感染部位几乎检测不到，表明FsEcm33通过激活宿主免疫限制病原菌定殖，从而负向调控毒力。

14-3-3蛋白FsBmh1与FsEcm33互作并影响其向F. sacchari细胞表面的定位。酵母双杂交、BiFC和pull-down实验均证实FsBmh1与FsEcm33直接互作。由于FsEcm33为GPI-AP，在胞质中完成GPI组装后定位于细胞表面，研究人员推测FsBmh1可能影响其分布。荧光显微镜观察显示，在O-FsEcm33菌株中细胞表面mCherry荧光较弱，而在ΔFsBmh1/O-FsEcm33中荧光显著增强。Western blot定量分析表明ΔFsBmh1/O-FsEcm33细胞壁中FsEcm33蛋白含量显著高于O-FsEcm33，说明FsBmh1减少了FsEcm33在F. sacchari细胞表面的积累。

FsBmh1与FsEcm33互作影响F. sacchari的毒力。将野生型CNO-1、ΔFsBmh1、O-FsEcm33和ΔFsBmh1/O-FsEcm33接种甘蔗后发现，O-FsEcm33毒力显著降低但高于ΔFsBmh1/O-FsEcm33。苯胺蓝染色显示O-FsEcm33和ΔFsBmh1/O-FsEcm33的定殖均受阻碍，ΔFsBmh1/O-FsEcm33在108 hpi时仅存少量残留菌丝。DAB染色显示ΔFsBmh1/O-FsEcm33感染部位ROS积累最高，表明FsBmh1与FsEcm33的互作通过调控FsEcm33的细胞表面分布影响病原菌毒力。

讨论部分，研究人员指出蛋白激发子因其触发植物免疫、增强多病原抗性的能力而备受关注。本研究鉴定了F. sacchari分泌型GPI-AP FsEcm33作为新型激发子，其功能存在物种特异性：在F. sacchari中定位于细胞表面并负向调控毒力，而对生长和孢子产量也有适度影响，过表达的抑制作用更为显著，可能与其破坏细胞壁正常组装或改变分泌模式有关。

FsEcm33与NbRE02的识别机制方面，RE02已报道识别Valsa mali的VmE02和Sclerotinia sclerotiorum的SCPSs，本研究证实FsEcm33与NbRE02直接互作，且NbRE02沉默削弱其诱导的细胞死亡。NbBAK1和NbSOBIR1为必需共受体，三者可能形成三元复合体转导免疫信号。FsEcm33在烟草、甘蔗、水稻、小麦和八角中均能增强抗病性，展现广谱应用潜力，但其他物种中RE02的同源物尚未发现，提示不同植物可能进化出不同的受体蛋白识别FsEcm33。

病原菌逃避宿主识别的策略多样：Pseudomonas syringae分泌碱性蛋白酶ArpA降解鞭毛蛋白单体；病原菌分泌几丁质结合效应蛋白或几丁质酶规避几丁质识别。本研究首次发现14-3-3蛋白FsBmh1可通过与激发子FsEcm33互作、阻碍其定位于细胞表面，帮助F. sacchari逃避植物免疫识别。毒力分析显示各菌株毒力与细胞壁FsEcm33含量呈负相关：FsBmh1结合FsEcm33减少其细胞表面暴露，从而逃避宿主免疫、促进定殖和毒力；而缺失FsBmh1或外施FsEcm33时，FsEcm33作为激发子触发PTI反应增强抗病性。

研究结论总结为：FsEcm33是一种新型激发子，可被受体样蛋白NbRE02识别从而触发植物免疫反应，并显著增强包括甘蔗在内的多种植物的抗病性。为逃避FsEcm33诱导的免疫反应，14-3-3蛋白FsBmh1在F. sacchari胞质中与FsEcm33互作，减少其向细胞表面的定位，该机制使病原菌维持对甘蔗的适度毒力。此研究为理解植物-病原菌协同进化提供了模型系统，FsEcm33有望成为新型生物农药用于减少病害危害、提高农业生产效率。