综述：GFPT1致病性变异所致先天性肌无力综合征研究进展

《Muscle & Nerve》：Review of Congenital Myasthenic Syndrome Caused by Pathogenic Variants in GFPT1

　　

谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转氨酶1（Glutamine:fructose-6-phosphate transaminase 1, GFPT1）催化己糖胺生物合成途径（hexosamine biosynthetic pathway, HBP）的第一步限速反应，生成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc）。GFPT1第9号外显子仅在横纹肌中进行特异性剪接，产生长亚型GFPT1-L，而在其他组织中则生成短亚型GFPT1-S。研究人员推测，进化过程中获得的GFPT1-L可能通过抑制横纹肌中的HBP，使更多葡萄糖进入糖酵解途径。GFPT1功能缺失性变异可导致肢带型先天性肌无力综合征（congenital myasthenic syndrome, CMS）。目前已报道115个家系的146例GFPT1-CMS患者，共检出71种致病性变异。患者平均发病年龄为8.3±10.1岁（范围0~69岁）。肢带肌无力、肌肉活检检出肌管聚集物（tubular aggregates, TAs）及血清肌酸激酶（creatine kinase, CK）升高的发生率分别为100%、66.7%和42.5%。眼睑、眼外肌、面部、延髓及呼吸肌受累罕见，发生率均低于七分之一。吡啶斯的明、阿米吡啶和沙丁胺醇的有效率分别为95.8%、76.3%和86.4%。机制研究显示，乙酰胆碱受体δ亚基的低糖基化很可能是乙酰胆碱受体簇集缺陷的关键原因。小鼠模型研究表明，骨骼肌完全缺乏GFPT1时，在6周龄即可出现CMS；而仅缺乏GFPT1-L时，需12个月才发展为CMS，这可能与低水平GFPT1-S的表达有关。与此一致的是，GFPT1-CMS患者中第9号外显子的无效变异富集。

1 GFPT1与GFPT2在己糖胺生物合成途径（HBP）中的作用

先天性肌无力综合征（CMS）是一类因神经肌肉信号传递缺陷导致的异质性疾病，特征为易疲劳性肌无力、肌肉发育不全及轻微畸形，目前已鉴定出40个致病基因，编码谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转氨酶1的GFPT1是其中之一。葡萄糖进入细胞后主要流向三条代谢途径：糖酵解途径生成三磷酸腺苷（ATP）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）；磷酸戊糖途径生成用于核苷酸生物合成的核糖-5-磷酸和NADPH；己糖胺生物合成途径（HBP）生成尿苷二磷酸-N-乙酰葡糖胺（UDP-GlcNAc），该分子是糖蛋白N-连接和O-连接糖基化以及糖胺聚糖和糖脂合成的关键底物。N-连接和O-连接糖基化对骨骼肌的维持和功能至关重要。大鼠附睾脂肪原代脂肪细胞中，HBP消耗的葡萄糖仅占2%~3%。UDP-GlcNAc还通过对信号分子的O-GlcNAc糖基化修饰调控信号通路，是应激反应和营养感知的代谢调节因子。

HBP的第一步限速反应由谷氨酰胺：果糖-6-磷酸转氨酶（GFPT）介导。哺乳动物具有旁系同源基因GFPT1和GFPT2，人与小鼠中两者的氨基酸序列相似性均为76%。根据GTEx项目数据，GFPT1和GFPT2在人类所有组织中均有不同程度普遍表达。人类骨骼肌中GFPT1的表达水平是GFPT2的5.20倍。GFPT2的酶活性低于GFPT1，但对UDP-GlcNAc反馈抑制的敏感性更低。与GFPT1类似，GFPT2在乳腺癌、结肠癌、胰腺癌和非小细胞肺癌中表达升高，但其研究程度远低于GFPT1。

GFPT1包含三个结构域：谷氨酰胺酰胺转移酶2型结构域（GATase）、糖异构酶结构域1（SIS1）和糖异构酶结构域2（SIS2），并以同源二聚体形式发挥作用。GATase结构域催化谷氨酰胺水解为谷氨酸和游离氨（NH₃），而SIS结构域利用GATase结构域传递的氨，催化果糖-6-磷酸（F-6-P）转化为葡糖胺-6-磷酸（GlcN-6-P）。

2 横纹肌特异性GFPT1-L可能为哺乳动物进化中获得，以促进更多葡萄糖进入糖酵解产能途径

GFPT1第9号外显子的可变剪接产生普遍表达的短亚型（GFPT1-S）和横纹肌特异性的长亚型（GFPT1-L）。人类和小鼠的骨骼肌几乎仅表达GFPT1-L，心肌同时表达GFPT1-L和GFPT1-S，而其他组织仅表达GFPT1-S。人类GFPT1第9号外显子编码18个氨基酸（54 bp），小鼠编码16个氨基酸（48 bp）。与GFPT1-S相比，GFPT1-L的最大反应速率（V_MAX）为53%，果糖-6-磷酸的米氏常数（K_M）为215%，UDP-GlcNAc的抑制常数（K_i）为20%，表明GFPT1-L酶活性更低，且对UDP-GlcNAc的反馈抑制更敏感。

RNA结合蛋白丝氨酸/精氨酸富含剪接因子1（SRSF1）和RNA结合fox-1同源蛋白1/2（Rbfox1/2）分别结合GFPT1第9号外显子和内含子9，协同增强第9号外显子的 inclusion，其机制是通过强化U1 snRNP在5'剪接位点的募集。相反，另一种RNA结合蛋白hnRNP H/F结合GFPT1第9号外显子并抑制其 inclusion。与两者在剪接中的功能一致，Rbfox1/2随肌管分化表达升高，而hnRNP H/F表达降低。

敲除GFPT1第9号外显子可显著升高GFPT1-S蛋白水平和UDP-GlcNAc/UDP-GalNAc水平，进而损害糖酵解能量生成，并导致神经肌肉接头（NMJ）形成和维持异常。这表明，进化过程中横纹肌获得GFPT1第9号外显子，可能是为了减弱HBP以保障高效的糖酵解能量生成。

3 导致GFPT1-CMS的致病性变异

2011年首次在22例伴肌管聚集物的肢带型CMS患者中报道了GFPT1致病性变异。目前已报道78种致病性变异，包括68个单核苷酸变异和10个插入缺失变异，其中34种为多次报道的复发变异，尤其c.44C>T、c.*22C>A和c.331C>T分别被报道7次、8次和9次。78种变异可分为55种错义变异、8种剪接变异、7种移码变异、6种无义变异、1种框内变异以及1种3'非翻译区（UTR）变异。

与仅携带错义变异的患者相比，携带无义、移码、剪接、大片段缺失或起始密码子变异的患者发病年龄显著更早，女性比例更高，且延髓肌受累更多。其他研究也支持纯合错义变异患者表型较轻的观点，而双侧等位基因功能缺失性变异累及肌肉特异性GFPT1-L时，表型严重，可出现呼吸暂停、重度肌张力减退和多关节挛缩。

致病性变异在任何结构域均未观察到聚类，GATase结构域存在变异与不存在变异的患者之间也无表型差异。第9号外显子的8种变异中，7种为移码或无义变异，仅1种为错义变异，下文将讨论该外显子无效变异富集的原因。

4 GFPT1-CMS的临床与治疗特征

截至目前，共报道115个家系的146例患者（部分患者在多篇研究中重复计数）。发病年龄为8.3±10.1岁（均值±标准差），范围0~69岁，10.4%为新生儿期发病，也有超过40岁发病的报道，但其延迟发病的环境或遗传因素尚不明确。

肢带肌无力、肌肉活检肌管聚集物（TAs）和CK升高分别占100%、67.9%和44.4%。在各类CMS中，GFPT1-CMS血清CK升高约为正常值3倍，慢通道CMS约为1.5倍，GMPPB-CMS约为10倍。智力障碍罕见（4.3%）。眼睑、眼外肌、面部、延髓和呼吸肌受累率分别为11.9%、9.9%、11.8%、8.3%和12.1%，因此GFPT1-CMS始终表现为肢带肌无力，眼部和延髓肌极少受累。除上述特征外，患者还可出现脊柱侧凸、高弓足、翼状肩胛、关节挛缩和高腭穹窿，罕见远端关节过伸、胸大肌发育不全、鸡胸和颅缝早闭。

吡啶斯的明有效率为95.8%，常无需联用其他药物。阿米吡啶和沙丁胺醇使用频率较低，但有效率分别为79.6%和89.7%。这三种药物对包括GFPT1-CMS、DPAGT1-CMS、ALG2-CMS、ALG14-CMS和GMPPB-CMS在内的糖基化缺陷型CMS普遍有效。

5 GFPT1-CMS的机制研究

Gftp1缺陷斑马鱼表现为尾部卷曲缩短、游泳和触诱发逃逸反应严重受损、体节异常及NMJ发育延迟，证实了GFPT1在NMJ中的作用。

患者来源的肌母细胞/肌管显示乙酰胆碱受体（AChR）的细胞膜表面表达显著降低。GFPT1抑制剂处理或Gfpt1沉默的TE671肌细胞中也观察到AChR表达减少，其原因可能是AChR α、δ和ε亚基稳态水平下降，而这很可能源于N-连接糖基化缺陷。

骨骼肌特异性敲除Gfpt1的小鼠表现为易疲劳性肌无力、肌纤维肌管聚集物，以及NMJ处AChR簇碎片化、体积缩小。尽管仅骨骼肌中Gfpt1被敲除，但仍观察到突触前异常，包括轴突排列紊乱、髓鞘变薄不规则和运动神经末梢重塑。小鼠肌肉还积聚了提示内质网-高尔基体应激的肌膜下囊泡结构。受累肌肉的蛋白质组学分析显示NMJ分化和维持相关蛋白上调。对同一敲除小鼠的分析表明，仅AChR δ亚基而非其他亚基发生低糖基化，这可能是患者来源肌母细胞/肌管中AChR细胞膜表面表达降低的原因。

研究人员构建了携带GFPT1-CMS患者第9号外显子移码变异的敲入小鼠模型。与上述完全缺乏骨骼肌GFPT1的敲除小鼠不同，敲入小鼠的GFPT1表达量为野生型的20%，原因是仍可生成少量GFPT1-S。敲入小鼠表现为UDP-GlcNAc/GalNAc、CMP-NeuAc和蛋白质O-GlcNAc糖基化水平显著降低。12月龄时，小鼠出现肌纤维肌管聚集物、运动表现下降、AChR簇碎片化和NMJ超微结构简化。6月龄时，骨骼肌Hsp70升高，但未观察到Grp78-p62共定位，提示存在适应性未折叠蛋白反应（UPR）。而12月龄时，骨骼肌中大量观察到Grp78-p62共定位，且凋亡标志物Chop和Bax被诱导，提示UPR转为失代偿状态。长期存在的因UDP-GlcNAc缺乏导致的内质网应激，可能随衰老促使UPR从适应转为失代偿。完全缺乏GFPT1-S/L与保留20% GFPT1-S表达，可能是两种小鼠模型发病年龄差异的原因。前文所述第9号外显子无效变异富集，可能反映了该外显子的错义变异可通过骨骼肌低水平表达GFPT1-S得到代偿，而无效变异则不能。

肌管聚集物存在于67.9%的GFPT1-CMS患者中，由来自肌浆网（SR）的致密膜小管构成。除GFPT1-CMS外，肌管聚集物也见于其他糖基化缺陷型CMS（DPAGT1-CMS和ALG2-CMS，但ALG14-CMS和GMPPB-CMS未见），以及钙处理异常相关肌病，如STIM1和ORAI1致病性变异导致的肌管聚集物肌病（TAM）和CACNA1S致病性变异导致的周期性瘫痪。基质相互作用分子1（STIM1）和钙释放激活钙调节因子1（ORAI1）是储存操纵性钙内流（SOCE）系统中的SR糖基化蛋白，当SR钙水平降低时介导钙摄取。低糖基化且功能缺陷的STIM1和ORAI1可能导致钙从SR向胞质转移，进而引发肌管聚集物。此外，敲入小鼠模型中因低糖基化导致的失代偿内质网应激也可能是肌管聚集物的形成原因。

3' UTR变异c.22C>A已在8项研究中被报道。研究显示该变异创建了miR-206的新结合位点，使GFPT1翻译水平降至野生型的66%。抗miR-26处理可显著挽救患者来源肌管中的GFPT1表达水平。由于miR-206在骨骼肌中高表达，GFPT1 mRNA的翻译在骨骼肌中被高效抑制。

与HBP类似，Leloir途径催化半乳糖转化为UDP-GalNAc，后者可通过UDP-GalNAc差向异构酶（GALE）转化为UDP-GlcNAc。在骨骼肌特异性Gfpt1缺陷小鼠中给予半乳糖，可挽救神经肌肉缺陷、改善肌肉疲劳、恢复NMJ形态并提高骨骼肌蛋白质O-GlcNAc糖基化水平，因此半乳糖有望成为GFPT1-CMS的潜在治疗选择。

6 结论

GFPT1-CMS主要表现为肢带肌无力，通常不影响眼肌、延髓肌和面部肌肉。肢带肌无力、血清CK轻度升高和肌肉活检肌管聚集物的组合，可能导致误诊为其他肌病。但重复神经电刺激递减反应以及对吡啶斯的明、阿米吡啶和沙丁胺醇的良好反应是鉴别诊断GFPT1-CMS的关键指标。