应用16S rRNA高通量测序诊断新生马驹菌血症

《Equine Veterinary Journal》：Diagnosis of bacteraemia in neonatal foals using 16S rRNA high-throughput sequencing

　　

摘要：背景：败血症是导致马驹发病和死亡的重要原因。早期诊断可改善预后，但非特异性临床症状和血液培养确认感染的延迟使诊断复杂化。分子检测是一种快速且更敏感的替代方法。目的：使用分子检测评估和比较患病与健康马驹血液及血液培养基（BCM）中的细菌载量和组成，并将结果与传统细菌培养进行比较。研究设计：横断面观察性临床研究。方法：纳入13匹败血症马驹、10匹患病非败血症马驹和8匹健康马驹。通过定量PCR（qPCR）和通用细菌16S rRNA标记基因测序，分析全血（WB）、预富集BCM和污染对照中的细菌载量和组成。结果：WB测序的阳性样本数（25/31）多于BCM（6/62；p < 0.01）。仅在3/12的马驹中，阳性血液培养与WB测序结果具有可比性。测序样本存在高度污染可能性，大多数样本中Paucibacter和Ralstonia的相对丰度（RAs）较高。然而，败血症马驹中Actinobacillus和Staphylococcus的高RAs可能提示了真正的病原体检测。在马驹组别之间以及WB与污染对照之间，未发现细菌RAs、16S rRNA基因载量（qPCR）或其他基于测序的指标存在显著差异。主要局限性：败血症和患病非败血症马驹分类方案固有的不准确性，以及对低生物量样本进行测序时污染的影响。结论：高通量测序为诊断马驹菌血症提供了一种可能的途径，但存在较高的环境和提取相关污染可能性，目前尚不能替代血液培养。有必要进一步研究以优化WB样本的检测产出和灵敏度。

### **论文解读：应用16S rRNA高通量测序诊断新生马驹菌血症的研究**

**研究背景与现存问题**
败血症是新生马驹发病和死亡的主要原因，通常由菌血症或严重感染（如肺炎、肠炎或脐炎）引发，并常与被动免疫转移失败相关。早期诊断和及时抗菌治疗对改善预后至关重要。然而，马驹败血症的诊断面临多重挑战。目前主要依赖与全身炎症反应综合征（SIRS）相符的临床病理学参数，并结合血液培养或局部感染源的确认。但这一过程受到非特异性临床症状、缺乏经过验证的败血症标准以及基于培养的确认方法延迟（通常需要数天）的阻碍。此外，血液培养的灵敏度被认为有限，特别是在涉及苛养菌、低细菌载量、多种微生物感染或已进行抗生素治疗的情况下。尽管已有多种败血症评分系统和生物标志物被评估，但大多数预测价值有限。因此，迫切需要一种快速、灵敏的诊断工具来早期确认败血症并指导治疗。分子检测，特别是基于16S rRNA的检测，作为识别菌血症的潜在替代或补充方法，展现出前景。本研究旨在评估16S rRNA宏基因组学（包括定量PCR和高通量测序）在诊断新生马驹菌血症中的可行性，并与标准血液培养进行比较。

**研究概况与核心结论**
本研究是一项横断面观察性临床试点研究，发表于《Equine Veterinary Journal》。研究人员评估了16S rRNA高通量测序和定量PCR（qPCR）在检测新生马驹血液中细菌DNA的可行性，并与传统血液培养进行比较。核心结论是：虽然该分子方法能够检测到马驹血液中的细菌DNA，但其结果与血液培养的一致性有限，且存在显著的环境和提取相关污染问题。研究未能在健康、患病非败血症和败血症马驹组间发现细菌相对丰度、16S rRNA基因载量或其他测序指标的显著差异。因此，尽管在特定病例中检测到已知病原体的高相对丰度提示了潜在的临床效用，但当前的测序方法缺乏足够的特异性和可靠性，尚不能替代或补充传统的血液培养。

**关键技术方法概述**
研究在2023年产驹季节于宾夕法尼亚大学新博尔顿中心进行，共纳入31匹新生马驹（日龄≤15天），分为三组：13匹败血症马驹、10匹患病非败血症马驹和8匹健康马驹。马驹的分类基于更新的败血症评分（Score 2）和年龄特异性SIRS标准。主要技术方法包括：1）**样本采集与处理**：无菌采集血液用于传统培养和分子分析。分子分析样本包括全血（WB）以及在血液培养瓶（需氧和厌氧）中孵育5小时（T5）和24小时（T24）后采集的血液培养基（BCM）。同时收集环境和提取对照以评估背景污染。2）**传统血液培养与鉴定**：使用自动化微生物检测系统进行需氧和厌氧血液培养，阳性样本通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行菌种鉴定，并进行抗菌药物敏感性试验（AST）。3）**分子分析**：使用试剂盒从WB和BCM中提取总DNA。通过针对16S rRNA基因V1-V2高变区的qPCR测定总细菌丰度。为进行测序，使用高保真DNA聚合酶对16S rRNA基因V1-V2区进行四重复PCR扩增，构建的文库在Illumina MiSeq平台上进行2×250 bp测序。4）**生物信息学与统计分析**：使用QIIME2和DADA2处理测序数据，生成扩增子序列变体（ASVs）。使用SILVA数据库进行物种分类。评估α多样性（如观察到的OTUs、香农指数、Faith's系统发育多样性）和β多样性（使用加权与非加权UniFrac距离，并通过主坐标分析PCoA可视化）。采用线性模型、PERMANOVA等统计方法比较组间差异，并应用污染识别和过滤方法（如基于PCR后DNA浓度的校正）来区分潜在污染物与真实病原体。

**研究结果详述**
**3.1 马驹队列特征**：研究共纳入31匹马驹（健康8匹，患病非败血症10匹，败血症13匹）。大多数为新生马驹（日龄<4天）。败血症组马驹的败血症评分中位数显著高于其他组。

**3.2 标准血液培养结果**：12匹马驹（败血症组9/13，患病非败血症组3/10）血液培养呈阳性。共鉴定出19株分离株，其中4例为多种微生物生长。分离出的微生物包括已知的马驹败血症病原体（如大肠杆菌、放线杆菌、克雷伯菌、肠球菌），也包括可能的皮肤或环境污染物（如葡萄球菌、短小杆菌、微杆菌）。

**3.3 环境与提取污染对照分析**：测序在大多数污染对照样本中产生了大量读数。Paucibacter和Ralstonia在污染对照和马驹WB样本中均呈现高相对丰度。β多样性分析（PERMANOVA）显示，马驹WB样本与污染对照样本的微生物谱无法可靠区分。通过分析特定类群相对丰度与PCR后DNA浓度的关系，发现Paucibacter和Ralstonia表现出污染物特征（相对丰度随总丰度增加而降低），而Actinobacillus和Staphylococcus则表现出真实病原体特征。应用PCR校正的ASV丰度阈值（0.43 ng/μL）进行过滤后，仅剩少数OTUs，其中包括在部分败血症马驹WB样本中呈现高校正丰度的Actinobacillus和Staphylococcus。

**3.4 全血样本的16S rRNA qPCR与测序结果**：qPCR在21/31匹马驹的WB中呈阳性，但组间无显著差异。测序在25/31匹马驹的WB中产生>1000条质量读数。WB中最丰富的五个属是Paucibacter（平均相对丰度44%）、Staphylococcus（10%）、Ralstonia（8%）、Actinobacillus（8%）和Paracoccus（5%）。值得注意的是，两匹败血症马驹的Actinobacillus相对丰度>93%，另两匹的Staphylococcus相对丰度>73%，提示可能的病原学作用。在马驹各组之间，以及马驹组与污染对照之间，大多数高丰度属的相对丰度无显著差异。α多样性指标在各组间也无显著差异。在加权UniFrac PCoA图中，四份败血症马驹的WB样本（两例Actinobacillus占主导，两例Staphylococcus占主导）表现为离群点，但PERMANOVA检验未显示组间或样本类型间β多样性存在显著差异。

**3.5 血液培养基的16S rRNA qPCR与测序结果**：BCM样本的分子检测产出率极低。qPCR仅在4/62份BCM样本中高于检测阈值，测序仅在6/62份BCM样本中产生结果。WB样本的测序阳性率显著高于BCM样本。

**3.6 血液培养与全血测序的比较**：血液培养与WB 16S rRNA测序结果仅在9/31匹马驹中一致。在败血症组中，仅在三例中部分匹配。六匹马驹两种方法均为阴性。在其余22匹中，9匹两种方法均为阳性（但检出的病原体不同，其中6例WB测序以Paucibacter为主），13匹测序阳性但培养阴性。两种方法的一致性一般，Cohen's Kappa系数为-0.4。

**3.7 相关性分析**：Actinobacillus的相对丰度与白细胞计数、中性粒细胞计数呈负相关，与测序读数呈正相关。Paucibacter的相对丰度与PCR后DNA浓度、测序读数、香农多样性指数呈负相关，支持其污染物特性。Paucibacter、Ralstonia和Paracoccus的相对丰度均与Actinobacillus的相对丰度呈负相关。

**讨论与结论总结**
**讨论部分**：本研究证明了使用16S rRNA测序检测新生马驹血液细菌DNA的可行性，但也凸显了其在低生物量样本中易受污染的重大挑战。与污染对照中类群的重叠表明，许多检测到的细菌可能源自环境或实验过程。尽管分子检测具有快速和潜在高灵敏度的优势，但其与血液培养的一致性有限，这可能是由于检测非活菌、苛养菌或污染物DNA所致。在临床败血症马驹中检测到高相对丰度和绝对丰度的已知病原体（如Actinobacillus和Staphylococcus），即使培养阴性，也可能代表真正的菌血症。然而，将细菌DNA特征视为败血症“标志物”而非直接病因的可能性也存在。本研究的局限性包括马驹分类的不精确性（依赖于不完善的败血症评分和SIRS标准）、样本污染的可能性以及分子检测无法提供药敏信息等。新生马驹的年龄因素也可能影响分类和结果。

**结论部分翻译**：这项试点研究证明了使用16S rRNA测序检测和识别新生马驹血液中细菌DNA的可行性，但也揭示了其局限性。与初始假设一致，该分子检测能够检测马驹血液样本中的细菌DNA，但在大多数情况下，它无法根据疾病状态区分马驹，也无法将其与环境样本区分开来。尽管与传统血液培养的一致性较低且污染构成主要挑战，但在特定病例中已知病原体的高相对丰度表明其在某些背景下具有潜在的临床效用。虽然这些发现目前不支持将16S rRNA测序作为识别新生马驹败血症的唯一诊断方法进行临床应用，但它们为了解技术缺陷、病原体检测模式以及解释马驹血液等低生物量样本中微生物DNA固有的复杂性提供了宝贵的见解。