《Veterinary Medicine International》：Methodological Factors Affecting Canine Vaginal Cytology: The Influence of Sampling Site, Swab Condition, and Fixation Method
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**背景：** 阴道细胞学（Vaginal Cytology）因其实用性和低成本而被广泛应用于母犬的发情周期（Estrous Cycle）分期；然而，其诊断可靠性受方法学变异性的强烈影响。本研究旨在评估采样部位、拭子类型和固定方法对脱落细胞阴道细胞学判读的影响
**背景：** 阴道细胞学（Vaginal Cytology）因其实用性和低成本而被广泛应用于母犬的发情周期（Estrous Cycle）分期；然而，其诊断可靠性受方法学变异性的强烈影响。本研究旨在评估采样部位、拭子类型和固定方法对脱落细胞阴道细胞学判读的影响。
**材料与方法：** 本研究从332只临床健康母犬采集脱落细胞阴道细胞学样本，这些母犬代表了发情周期的所有阶段。样本分别从不同部位（阴道前庭 vs. 阴道）采集，使用干拭子或盐水湿润拭子，制备成风干或喷雾固定的涂片，随后进行伊红-噻嗪（Eosin-Thiazine）染色。临床检查和血清孕酮（Progesterone, P4）浓度作为发情周期分期的参考方法。
**结果：** 不同细胞类型的比例受采样部位的显著影响。阴道前庭涂片中角化细胞和中间细胞的比例较高（p < 0.0001），而基底细胞（p = 0.0078）和无核表层细胞（p < 0.0001）在阴道涂片中更为常见。总体而言，采样部位显著影响了发情前期（Proestrus）与发情期（Estrus）的区分。拭子条件显著影响涂片质量和细胞呈现方式，但对发情周期分期分类的影响极小。使用盐水湿润拭子获得的涂片每高倍视野细胞产量显著更高（p < 0.0001）。细菌、细胞碎屑和分泌性物质在湿润涂片中较少见（p < 0.0001），而游离细胞核更为常见（p < 0.0001）。棉纤维在干拭子制备物中更常见（p < 0.0001）。细胞排列方式也因采样方法而异（p = 0.003）。固定方法影响某些形态学特征，但不影响细胞学分期分类。风干与喷雾固定涂片之间的总细胞产量无显著差异。
**结论：** 在评估的所有因素中，仅采样部位对发情周期分期判定产生临床相关影响，特别是对于发情前期与发情期的区分。
本研究发表于《Veterinary Medicine International》，旨在系统评估影响母犬阴道细胞学诊断可靠性和可重复性的方法学因素，为犬繁殖管理中这一常用技术的标准化提供循证依据。
**研究背景与问题提出**
在犬繁殖管理领域，特别是控制性育种项目中，精确诊断发情阶段的重要性日益凸显。现代繁殖实践中，母犬常被长距离运输至选定的种公犬处，准确预测最佳配种时间对于确保成功受精和最大化产仔数至关重要。这一精确性在人工授 branching programs中同样关键，因为精子经长时间储存特别是冷冻保存（Cryopreservation）后，其受精能力可能下降，从而缩短受孕期窗口并提高对精确周期分期的需求。阴道细胞学作为确定母犬繁殖阶段最常用的方法之一，是一种实用的工具，可用于缩小血清孕酮采样的时间范围；但需注意，它不能替代孕酮检测，特别是在需要精确确定排卵时间的情况下，如使用冷冻精液配种时。
阴道上皮的脱落细胞变化能够密切反映潜在的激素动态变化，并可靠地区分发情前期、发情期和发情后期早期。然而，发情后期中晚期可能表现出与乏情期（Anestrus）相似的细胞学特征，此时需要血清孕酮测定以准确区分周期阶段。尽管阴道细胞学在兽医文献中已有广泛描述，但与人妇产科不同，犬繁殖医学中尚无普遍接受的样本采集、处理和评估标准指南。采样技术、涂片制备、固定方法、染色方案和评估标准的变异十分常见，导致已发表文献中阴道细胞学的描述和诊断解释存在显著不一致。值得注意的是，尽管相关文献丰富，但专门 addressing individual cytological methods reproducibility and diagnostic reliability的研究仍然匮乏。
**研究设计与核心发现**
研究人员设计了三组实验来系统评估方法学变量的影响。实验一评估采样部位效应，比较阴道前庭与颅侧阴道采样的细胞学差异，纳入120只母犬；实验二探究拭子条件影响，比较干棉拭子与盐水湿润棉拭子的效果，纳入106只母犬；实验三检验固定技术影响，比较风干与喷雾固定涂片，纳入106只母犬。所有样本均经伊红-噻嗪快速染色，并以临床检查结合血清孕酮浓度作为金标准进行周期分期。
**采样部位的显著影响**
研究发现采样部位对细胞学组成具有显著影响，这是唯一对发情周期分期判定产生临床相关效应的因素。阴道前庭涂片中角化表层细胞（高度角化细胞，Highly Keratinized KZ Superficial Cells）和中间细胞比例显著更高（p < 0.0001），而基底细胞（p = 0.0078）和无核表层细胞（p < 0.0001）在阴道涂片中更为常见。当将细胞学发现分配至不同发情周期阶段时，两处采样部位的判读差异仅出现在发情期。所有发情期母犬的阴道涂片均呈现典型的发情期细胞学模式，而近半数对应的配对阴道前庭涂片仍显示发情前期模式。这表明阴道前庭上皮作为向皮肤组织过渡的区域，其激素反应性较弱，雌激素诱导的细胞变化不如阴道上皮明显，因此阴道前庭细胞学虽可用于一般周期监测，但在精确确定最佳配种时间方面敏感性不足。
**拭子条件的技术优势**
拭子条件显著影响涂片质量和细胞呈现方式，但对周期分期分类影响极小。盐水湿润拭子获得的涂片每高倍视野细胞产量显著更高（p < 0.0001），细菌、细胞碎屑和分泌性物质显著减少（p < 0.0001），棉纤维伪象也更少（p < 0.0001），背景更为清洁。然而，湿润拭子涂片中游离细胞核更为常见（p < 0.0001），细胞排列方式也有所不同：干拭子涂片中细胞多呈孤立分布，而湿润拭子涂片中簇状聚集更为常见（p = 0.003）。尽管如此，106对样本中98%（104/106）的发情周期分期分类完全一致，说明对于发情阶段判定，干拭子与湿润拭子的选择诊断学上等效。
**固定方法的有限影响**
风干与喷雾固定方法在总细胞产量上无显著差异，但空气干燥涂片中细菌和分泌性物质更多（p = 0.0005），细胞边缘卷曲现象更常见（p = 0.0011）。研究人员推测这可能是由于细胞学喷雾的稀释或置换效应所致。重要的是，99%（105/106）的配对涂片经两种固定方法处理后获得相同的发情周期分期分类，表明短期风干是诊断可靠且便于临床操作的替代方案，仅在需要长期储存或延迟评估时才需考虑喷雾固定。
**关键技术方法**
本研究采用前瞻性配对设计，以德吉森大学繁殖医学诊所332只临床健康母犬为样本队列。每位受试动物均采集配对样本，通过管状阴道窥镜（Tubular Vaginal Speculum）分别自颅侧阴道和阴道前庭顺序采集，使用标准化无菌棉拭子（150 mm长，4 mm轴径，10 mm棉头直径）进行旋转取样，立即在脱脂载玻片上以三平行涂痕滚制备涂片。细胞学评估由单一兽医繁殖专科医师完成，每涂片随机选取至少4个视野计数200个上皮细胞，按基底细胞、旁基底细胞、中间细胞、表层细胞、无核表层细胞及高度角化表层细胞六类进行分类。发情周期分期由欧洲动物繁殖学院（European College of Animal Reproduction, ECAR）认证医师综合病史、行为观察、临床检查、阴道镜所见、细胞学特征及血浆孕酮浓度最终确定。
**研究结果分述**
"采样部位对阴道细胞学的影响"显示，120对配对样本中两处细胞组成存在显著差异，阴道前庭优先保留角化和中间细胞，而颅侧阴道更准确反映基底和无核表层细胞群体，20例发情期母犬的阴道前庭涂片被误判为发情前期。
"拭子条件对阴道细胞学的影响"显示，106对配对样本中湿润拭子细胞产量更高、背景更清洁，细胞分布模式从孤立向巢状转变，但仅2例分期不一致。
"固定方法对阴道细胞学的影响"显示，106对配对样本中两种固定方式总细胞产量相当，喷雾固定减少背景和细胞变形，但仅1例分期不一致。
**讨论与结论**
研究人员在讨论部分深入分析了各方法学因素的作用机制。阴道黏膜为激素反应性黏膜上皮，而阴道前庭黏膜构成向皮肤组织的过渡区域，故雌激素诱导的细胞变化在阴道更为显著。湿润拭子的稀释冲洗效应可产生更清洁的涂片背景，同时更高的细胞产量促进簇状形成。喷雾固定的稀释置换效应可减少背景物质，但不影响已采集细胞的类型分布。
研究结论指出，母犬阴道前庭细胞学是常规阴道细胞学的实用可靠替代方案，无需器械即可简便采集，能够准确反映周期性生殖变化；但其在精确确定最佳配种时间方面敏感性不足，因雌激素依赖的细胞学改变较阴道上皮明显减弱。盐水湿润拭子可显著提高样本质量，增加细胞产量并减少细菌、碎屑、分泌物和棉纤维；而细胞学喷雾固定对短期储存并非必需，短期风干是诊断可靠且面向临床实践的替代方案，仅在预期较长储存或延迟评估时才具应用价值。
**研究意义**
该研究为犬繁殖临床提供了重要方法学依据，证实采样标准化是确保阴道细胞学诊断准确性的核心要素。研究成果有助于建立标准化、可重复且便于临床应用的细胞学操作规范，降低因技术变异导致的发情分期误判风险，对优化繁殖管理效率、提升人工授精和冷冻精液使用成功率具有直接的临床应用价值。
