综述：活性氧（ROS）诱导的冷冻保存牛精子损伤及其缓解策略

《Veterinary Medicine and Science》：Reactive Oxygen Species-Induced Damage in Cryopreserved Bovine Sperm: Mitigation Strategies

　　

背景：精子冷冻保存在 cattle production 中的重要性在于其能够实现遗传变异的流通以及遗传优良公牛的速度分发。尽管如此，由于解冻后精子质量始终较差且在不同种公牛间存在显著差异，该技术仍存在相当大的技术缺口。
目的：本综述旨在探究牛精子冷冻保存过程中活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成的来源，讨论ROS诱导损伤的影响，并呈现研究人员可采取缓解氧化应激影响的现有知识。
方法：通过检索相关科学数据库，使用以下关键词进行全面的文献综述：bull sperm cryopreservation、ROS、oxidative stress、antioxidants、non-antioxidants approaches 和 post-thaw sperm quality。
结果：冻融应激引起极端的细胞和分子应激以及ROS过度产生，这是精子损伤的主要原因之一。ROS产生的主要原因包括渗透压变化、冰晶存在、线粒体功能障碍和氧化爆发。反过来，ROS的过度产生导致质膜的脂质过氧化（lipid peroxidation, LPO）、蛋白质氧化、DNA断裂和线粒体功能障碍，最终降低精子活力、存活率和受精能力。酶促和非酶促抗氧化剂、植物提取物、纳米颗粒、线粒体靶向抗氧化剂以及非抗氧化方法已被证明在抑制氧化损伤方面有效。
结论：在冷冻保存过程中预防氧化失衡是提高解冻后精子质量以及提高牛人工授精和体外受精项目成功率的重要因素。

1 引言

活性氧（reactive oxygen species, ROS）是从氧气产生的极具反应活性的分子，可以是自由基（存在未配对电子）或非自由基。ROS包括超氧阴离子（O₂^•?）、羟自由基（HO^•）、一氧化氮（NO^•）和过氧自由基（ROO^•）等具有未配对电子的自由基。其他具有氧化特性但非自由基的ROS包括过氧化氢（H₂O₂）、过氧亚硝酸盐（ONOO^?）、单线态氧（¹O₂）和次氯酸（HOCl）。它们作为细胞代谢的产物产生，主要在线粒体中，在生理水平上在精子功能中发挥必要作用，例如获能、超活化及顶体反应。然而，ROS产生升高可能压倒内在抗氧化防御系统，导致氧化应激，破坏质膜完整性、DNA稳定性、线粒体效率，最终导致受精潜力丧失。

牛精子在冷冻保存过程中特别容易受到ROS诱导的损伤，因为其质膜中含有大量多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs），这些脂肪酸极易发生脂质过氧化。此外，精子具有非常有限的细胞质体积，导致超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）等内源性抗氧化酶供应不足。在冻融过程中，温度的快速变化、渗透应激和冰晶形成破坏线粒体功能，导致ROS的过度产生，这经常使解冻后精子质量恶化。

为应对这些挑战，已探索了多种策略来缓解氧化应激并提高冷冻存活率。抗氧化剂（酶促和非酶促）通过清除和中和ROS发挥主要防御机制作用。此外，药用植物和植物化学物质因其天然抗氧化潜力而受到关注。近来，纳米颗粒作为创新方法出现，提供靶向抗氧化递送、增强ROS清除和改善解冻后精子存活。与这些方法并行，线粒体靶向抗氧化剂在减少氧化应激和改善精子冷冻存活方面显示出有前景的结果，而非抗氧化方法如冷冻保护剂优化、氧张力控制、缺陷精子去除、精浆管理和渗透应激最小化也显示出在提高精子质量参数方面的显著潜力。

2 ROS与精子生理学

高质量的精子对成功的动物繁殖至关重要，但ROS的产生是这一过程中的主要障碍。ROS对精子生理学具有调节和有害双重影响。最佳ROS水平维持功能性氧化还原状态，在精子成熟、超活化、顶体反应及精子-卵母细胞融合等生殖事件中发挥关键生理作用，这归因于其短半衰期和有限扩散。ROS在精子生理学中的主要功能在哺乳动物中普遍保守，但牛精子具有物种特异性特征使其更容易受到氧化应激的影响。特别是，公牛精子膜中PUFAs的百分比极高，且细胞质体积较小降低了内源性抗氧化酶的可及性。因此，牛精子更容易受到由ROS引起的LPO，特别是在冷冻保存程序中，这是牛繁殖技术中的主要问题之一。ROS是呼吸作用的主要副产物，源自线粒体复合物I和III以及精子活动。功能正常的精子产生更高水平的ROS，但过量的ROS或ROS产生与精浆抗氧化缓冲能力之间的不平衡可能导致氧化应激，可能对精子造成不可逆损伤。过量ROS产生的氧化应激已知会阻碍正常精子功能并影响不育。ROS还与细胞脂质、蛋白质和精子DNA的损伤相关，这可能对正常胚胎发育和后代长期健康产生深远影响。

3 牛精子冷冻保存过程中ROS生成的来源与机制

在冷冻保存过程中，牛精子经历剧烈的物理和生化应激，促进ROS的过度产生。几种主要来源和机制参与其中。

3.1 线粒体电子传递链（electron transport chain, ETC）泄漏

哺乳动物线粒体的三羧酸循环和ETC已被确定存在多个超氧化物和H₂O₂合成的潜在位点。在正常生理条件下，约0.2%–2%的ETC电子偏离其通常的传递途径，提前与氧气反应，导致超氧化物或过氧化氢的形成。因此，电子泄漏描述的是电子在到达复合物IV之前从ETC逃逸的过程，正常情况下它们会在复合物IV被还原为水。

3.2 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH）氧化酶（NOX）系统

NADPH氧化酶（NOX）亚型是各类细胞中产生O₂^•?和H₂O₂的一类酶，被认为是氧化还原信号的必需组成部分。已揭示NADPH氧化酶5（NOX5）是某些哺乳动物精子（如人和马）中ROS产生的关键来源。冷冻-解冻过程中的冷休克和钙内流可以刺激该酶。需要注意的是，牛精子中NOX5活性的阳性迹象很少。牛NOX5直系同源物及其在冷冻保存中的调控过程可能与人和马精子中描述的过程不同，因此需要物种特异性研究。

3.3 精浆/稀释液中的黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase, XO）活性

XO在嘌呤代谢中起关键作用，将嘌呤核苷酸转化为尿酸。在冷却或冷冻过程中，ATP水平降低激活精浆或稀释液中的XO，其代谢次黄嘌呤和黄嘌呤产生ROS，主要是超氧化物（O₂^•?）和H₂O₂。其功能是催化作为嘌呤分解代谢最终产物的尿酸的生成。

3.4 死亡或损伤的精子

在冷冻-解冻过程中，冷冻保存不可避免地导致一部分精子不可逆损伤或死亡。死亡精子被认为是精浆中通过芳香族L-氨基酸氧化酶（L-amino acid oxidase, LAAO）途径产生ROS的主要来源。当精子膜完整性受损时，LAAO酶与冷冻稀释液和稀释剂中存在的芳香族L-氨基酸接触，导致脱氨反应和H₂O₂的产生。因此，某些精子细胞的ROS介导死亡可能对剩余活精子的活力产生负面影响并降低其存活率。

3.5 白细胞污染

精液中的白细胞包括粒细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞。活化白细胞释放的蛋白酶、ROS和细胞因子可引起LPO和DNA断裂。即使精液或稀释剂中微量存在的白细胞，特别是中性粒细胞和巨噬细胞，也会对精子产生负面影响。这些免疫细胞在精液采集、处理、冷却或冷冻时被激活，作为回应，它们产生呼吸爆发，这是由NADPH氧化酶介导的酶促过程，产生大量ROS，包括超氧阴离子（O₂^•?）及其衍生物。

3.6 一氧化氮（nitric oxide, NO）爆发和活性氮物种（reactive nitrogen species, RNS）

RNS浓度升高，特别是过氧亚硝酸盐，诱导亚硝化应激，这是导致精子功能降低的关键因素。NO是一种高反应活性、半衰期短的气态分子，通过NADPH依赖的L-精氨酸向L-瓜氨酸的转化由一氧化氮合酶（nitric oxide synthases, NOSs）产生。然而，过量NO水平已被证明对体外人精子的活力、存活率和代谢产生不利影响。尽管这一证据基于人精子研究，但亚硝化应激的基本过程可能在哺乳动物物种中保守。不过，在直接得出结论之前，冷冻保存过程中NO毒性的程度和水平必须在牛中直接验证。

3.7 氧气浓度和稀释液组成

精液稀释液的组成及其含氧量是影响冷冻保存过程中精子氧化应激的关键外部因素。尽管氧气对活细胞的生存必不可少，但它也能产生自由基——高活性ROS，与碳水化合物、脂质和蛋白质等关键细胞成分相互作用。这些相互作用可能损伤细胞膜，最终导致细胞死亡和衰老。由于氧气分子是酶促和非酶促氧化还原过程的底物，稀释液中高浓度溶解氧促进ROS的形成。

3.8 抗氧化防御的耗竭

在正常情况下，精子依赖非酶促抗氧化剂如还原型谷胱甘肽（reduced glutathione, GSH）、维生素和硫醇，以及酶促抗氧化剂如GPx、CAT和SOD来中和ROS并维持氧化还原稳态。然而，冻融循环过程中细胞内抗氧化池显著减少。因此，冷冻存活率可能较低，最多约50%–60%的精子保持活力。

4 ROS相关的精子质量下降

过量ROS可通过多种机制负面影响精子功能，因为它们对脂质、蛋白质和DNA等关键细胞成分造成损伤。

4.1 脂质过氧化

精子中的LPO发生在ROS攻击精子质膜中的PUFAs时，导致脂质的氧化降解。这一过程破坏膜完整性和流动性，从而损害精子活力、顶体反应及与卵母细胞相互作用的能力。ROS通过降低细胞内ATP水平、损伤轴丝和引起结构改变触发LPO——这些影响损害精子活力和存活率，这是由于精子中段高浓度的线粒体所致。氧化剂，包括自由基和非自由基物种如超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基，靶向含有碳碳双键的脂质，特别是PUFAs。这启动了涉及氢提取和氧插入的链式反应，产生脂质过氧自由基和氢过氧化物。结果是自催化、自我传播的过程，使膜不稳定。

当LPO级联结束时，形成高度反应性的副产物如丙二醛（malondialdehyde, MDA）、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal, 4-HNE）、丙烯醛和异前列腺素。这些化合物通过增加膜通透性、降低膜电位、破坏线粒体功能和诱导DNA损伤进一步损害细胞完整性，从而降低受精潜力。通过与DNA碱基和糖骨架的相互作用，ROS造成以碱基修饰、无碱基位点、染色体重排、移码、缺失、DNA-DNA交联和微缺失为特征的遗传损伤。

4.2 蛋白质损伤

ROS损伤结构和功能蛋白质，氧化应激是精子蛋白质改变的主要原因。由于精子高度依赖特化蛋白质实现运动、膜完整性和受精，且细胞质抗氧化水平低，因此特别容易受到影响。在ROS对某些氨基酸（如半胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸，它们含有易受氧化的硫或芳香基团）的影响下，发生蛋白质氧化。能量代谢的酶促蛋白质（包括糖酵解和线粒体酶）的氧化损伤干扰ATP的产生，而这是运动、获能和受精所必需的。精子中的蛋白质氧化靶向细胞骨架肌动蛋白和微管蛋白，这些是一些关键蛋白质。肌动蛋白和微管蛋白的氧化使细胞骨架完整性解离，导致精子活力和鞭毛运动降低。

4.3 DNA损伤

对于成功的辅助生殖技术（assisted reproductive technology, ART），精子的DNA完整性是关键因素。精子ROS与DNA损伤之间存在显著正相关。ROS对精子DNA的损伤最终导致DNA双螺旋断裂。精子DNA紧密包装并压缩，包裹在鱼精蛋白中。这种压缩本身作为抵御外部损伤的防御机制，但由于精子DNA没有足够的DNA修复机制，且DNA在某些位置（特别是涉及早期胚胎发育的位置）松散包装，它仍然易受氧化应激的影响。碱基改变、链断裂和氧化性病变是ROS（特别是羟自由基）与DNA碱基相互作用的结果。羟自由基通过附着在DNA碱基的双键上从脱氧核糖糖提取氢，导致DNA链断裂和碱基释放。鸟嘌呤的氧化产生8-羟基脱氧鸟苷（8-OHdG），这是最知名的氧化DNA加合物之一。精子DNA损伤可导致多种生育相关问题，如受精受损、胚胎发育受损，甚至可能导致后代自发流产或发育问题。氧化性DNA断裂与精子活力降低和形态异常相关，降低受精机会。

4.4 细胞凋亡

ROS导致线粒体呼吸降低和线粒体氧化还原稳态紊乱，导致ATP产生减少和钙稳态改变，最终导致细胞死亡。这是细胞损伤和氧化应激降低精子质量和雄性生殖能力的关键机制。

4.5 线粒体功能障碍

精子线粒体是ROS产生的主要位点之一。线粒体功能障碍降低精子活力、顶体反应率、获能率和DNA完整性。中段精子线粒体形成围绕轴丝的鞘，在ATP产生中起作用，而ATP被认为激活和驱动精子运动，因此精子线粒体数量越多与更快的游动相关。

4.6 过早获能和顶体反应

冷冻保存过程中ABHD16B的丧失破坏膜脂质平衡（二酰甘油DAG和磷脂酰胆碱PC），使精子更容易受到ROS诱导的损伤和过早获能及顶体反应，从而导致雄性不育。精子获得受精能力所需的生理和生化变化统称为"获能"。自发性顶体反应（spontaneous acrosome reaction, sAR）可能发生在精子与卵丘卵母细胞结合之前，因此降低受精能力。

4.7 精子-卵母细胞相互作用的损害

ROS的过度产生可能通过促进LPO、蛋白质氧化和精子质膜的结构破坏（如顶体区，这对透明带穿透至关重要）损害精子-卵母细胞相互作用。此类氧化性改变破坏精子运动、获能和顶体反应，最终降低实现受精的潜力。

5 ROS的缓解策略

精子中ROS的缓解侧重于保护细胞免受氧化损伤并保存其受精潜力。这可以通过补充抗氧化剂、植物提取物、纳米颗粒、线粒体靶向抗氧化剂和非抗氧化方法实现，以确保更好的活力、膜完整性和整体精子质量。有趣的是，各种技术在运作方式、有效性和实用性方面差异很大。酶促抗氧化剂如SOD和CAT通过直接清除初级ROS发挥作用，但由于它们是蛋白质性质的，不具备渗透膜的能力。然而，非酶促抗氧化剂能够轻易穿透膜，但其抗氧化能力和最佳剂量变化很大。植物提取物具有多靶点保护效应，具有成本效益并含有包括多酚和黄酮类化合物在内的化合物，但植物化学成分的非均一性是标准化中的问题。纳米颗粒具有改善靶向递送和随时间中和ROS的潜力，尽管在高浓度时存在细胞毒性效应的担忧。与此同时，线粒体靶向抗氧化剂提供更集中的方法，更直接地靶向ROS的主要细胞内来源，但需要更多的剂量和制剂优化才能广泛应用。因此，对这些方法进行比较分析对于开发理性和基于证据的补充策略极为重要。

5.1 酶促抗氧化剂

酶促抗氧化剂如SOD、CAT和GPx在减少冷冻保存牛精子的ROS诱导损伤中起核心作用。单次冻融循环显著降低内源性防御（↓SOD、↓GSH），导致LPO和功能丧失。在稀释剂中添加SOD可减少MDA产生并显著增强精子活力。CAT解毒冷却过程中产生的H₂O₂；添加CAT已被证明可增强活力、顶体完整性并降低MDA水平。GPx系统，特别是GPx4，通过还原脂质氢过氧化物保护膜，其活性与精子活力和冷冻存活呈正相关。除此之外，过氧还蛋白（peroxiredoxins, PRDXs）作为补充的过氧化物清除剂，冷冻过程中PRDX5/6的转位表明它们在精子氧化防御中的作用。总体而言，优化稀释剂中酶促抗氧化活性可降低ROS负荷、稳定膜和线粒体并改善繁殖 outcomes。

现有证据的严格评估指出若干局限性。外源酶促抗氧化剂在牛精液中的大多数益处在单实验室小样本研究中报告，尚未经独立验证。此外，文献中的优选剂量范围不仅在不同研究之间而且在不同牛品种之间都存在差异，意味着个体间变异性（这已是牛精液冷冻保存中的已知问题）可能对酶补充反应产生强烈影响。外源蛋白质如SOD和CAT也膜通透性较差且固有限制，因此主要在细胞外空间发挥作用，使其对细胞内或线粒体ROS的效果较差。综合这些局限性突出了进行标准化的多品种剂量优化研究以及创建增强酶促抗氧化剂膜通透性的制剂的必要性。

5.2 非酶促抗氧化剂

非酶促抗氧化剂在保护牛精子免受ROS诱导的冷冻损伤中发挥关键作用。各种研究人员利用了不同类型的非酶促抗氧化剂。维生素E（α-生育酚）是一种脂溶性抗氧化剂，其在稀释剂中的补充可改善活力和存活率，并降低MDA和H₂O₂产生。

稀释剂中加入5 mM维生素C显著增加活精子、顶体完整性和HOST阳性精子，同时显著降低精子异常率和MDA水平。谷胱甘肽是直接清除ROS的主要细胞内非蛋白质巯基分子，其掺入降低ROS水平和DNA断裂，防止过早获能。l-肉碱是参与中间代谢多种作用的重要分子。雄性生殖系统中检测到的高浓度肉碱，特别是附睾中，提示其在能量代谢和精子成熟中的关键功能。研究显示，在解冻后阶段，l-肉碱组的活力、HOST反应精子和存活率显著更高，而精子异常率低于对照组。牛磺酸是一种磺基氨基酸和非酶促清除剂，保护精子免受LPO。含牛磺酸的稀释剂改善存活率、顶体完整性、质膜完整性、活力、精子胆固醇含量以及精子动力学和速度。褪黑素是一种两亲性激素，作为有效抗氧化剂稳定线粒体功能并保护精子DNA，从而在冷冻保存过程中改善活力并减少细胞凋亡。掺入褪黑素可提高活动精子百分比和快速精子百分比。辅酶Q10主要存在于精子细胞的线粒体中，其在精液中的水平与精子特性相关。Tris稀释剂中整合CoQ10可改善精子移动性、存活率、质膜完整性并减少异常。它还保护牛精子免受顶体损伤。藏红花中的生物活性类胡萝卜素藏红花素和藏红花酸是有效抗氧化剂，清除ROS、保护精子DNA并稳定膜。藏红花素和藏红花酸的应用有效保存了体外孵育整个期间的精子质量。槲皮素是一种黄酮类抗氧化剂，改善精子DNA完整性并减少GSH耗竭，增加SOD和GPx活性。白藜芦醇是一种存在于多种水果中的多酚，由于其自由基清除活性具有强大的抗氧化能力，导致ROS形成和LPO减少。精子白藜芦醇预处理降低ROS和MDA水平，维持存活率、顶体完整性和线粒体活性。姜黄素是一种植物多酚，主要来源于姜黄根茎。天然姜黄素的抗氧化活性是维生素E的8倍、维生素C的2.75倍。姜黄素可转移电子或提供氢原子，清除反应性自由基，触发细胞保护信号并减少细胞氧化损伤。姜黄素通过清除过氧化氢调节抗氧化活性，其在稀释剂中的剂量增加GSH和MMP水平，降低ROS和MDA水平并改善受精。番茄红素补充显著改善精子活力并保持线粒体活性，减少ROS和超氧化物产生，并降低蛋白质羰基、LPO和氧化性DNA损伤。

儿茶素（catechin, CT）是一种存在于植物中的抗氧化多酚：表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin 3-gallate, EGCG）、表儿茶素和表没食子儿茶素是重要的膳食儿茶素示例。它们掺入精液稀释剂保护细胞免受不稳定化学物质即自由基产生的损伤，改善精子活力、存活率并减少ROS产生、蛋白质羰基、LPO和氧化性DNA损伤。向精液稀释剂补充染料木黄酮可改善牛精液中精子的抗氧化性能，抑制冷冻保存过程中的氧化应激，减轻精子顶体和线粒体的冻融损伤，并改善解冻后精子的活力表现。乳铁蛋白由附睾、前列腺和精囊分泌。乳铁蛋白主要通过螯合游离铁发挥作用，从而防止通过Fenton反应产生ROS。它还稳定细胞膜并保护精子免受氧化应激诱导的损伤。乳铁蛋白减少精子活力的早期下降并促进获能相关变化。在氧化应激下，它保护鞭毛运动和渐进运动免受损失。在冷冻-解冻精子中，它改善存活率并减少凝集。

总体而言，关于非酶促抗氧化剂在牛精子冷冻保存中使用的科学文献庞大但非常不一致。尽管已报告多种化合物和剂量具有有益效果，但在相同实验系统中进行的直接比较研究很少，难以建立明确的效力顺序。此外，其他研究显示仅在特定浓度下有积极效果，而高浓度下有抑制甚至细胞毒性效果，这也强调了剂量优化的至关重要性。脂溶性抗氧化剂（维生素E、番茄红素和姜黄素）似乎对膜LPO有稳定的负面影响， compared with more variable effects of the water-soluble antioxidants (vitamin C and glutathione) which might be due to variations in extender composition and dilution procedures.

5.3 植物提取物

药用植物因其显著的健康益处在男科学中越来越受欢迎。植物和草药的适当提取和评估对于探索其抗氧化潜力至关重要。植物提取物是天然抗氧化剂的来源，它们作为保护性和改善冷冻保存过程中精子功能的廉价天然添加剂来源受到关注。许多植物提取物含有多种多酚、黄酮类和生物活性化合物，作为抗氧化剂中和ROS、减少LPO并稳定精子膜，从而提高解冻后精液质量。

多种植物和草药已被研究用于精液冷冻保存的保护潜力。例如，迷迭香、姜、金盏花、葡萄、接骨木、五味子、辣木、Albizia harveyi、柿子、东革阿里、牛至、荨麻、石榴、Syzygium cumini、Pinus Brutia Ten.和欧当归据报道具有较高的抗氧化活性，减少氧化应激，提高解冻后公牛精液的总精子活力、渐进精子活力、精子存活率和精子质膜完整性，并降低ROS产生、蛋白质氧化和LPO。不同独立研究使用各种植物物种的结果一致表明，富含多酚和黄酮的提取物具有强大的冷冻保护活性，这主要通过抗氧化剂和膜稳定剂的作用实现。然而，尽管植物提取物在提高解冻后精子质量方面普遍存在，有效浓度可能因植物来源性质、提取程序（水提、乙醇提取或甲醇提取）和溶剂类型而异，因此难以进行直接比较。

大多数研究在受控实验室条件下进行，使用少量公牛，这可能不能反映田间的生物学变异。此外，大量证据集中于短期体外发现，体内生育试验有限，无法验证受孕率的实际变化。导致这些效果的确切生物活性化合物尚不十分明确，且提取方法、地理位置和收获方式不同，阻碍了标准化。此外，增加剂量可能引起的细胞毒性强调了在实用化之前逐例优化的必要性。

5.4 纳米颗粒

基于纳米技术的抗氧化剂因其高递送能力和高ROS清除能力正成为最佳牛精液冷冻保存剂之一。这些纳米材料可根据其作用方式进一步分为两个功能不同的组：载体型/间接作用纳米材料和固有生物活性纳米材料（纳米酶）。第一类的纳米材料包括壳聚糖纳米颗粒（chitosan nanoparticles, CS-NPs）和腐殖酸-锌纳米颗粒（humic–zinc nanoparticles, HZn-NPs），主要用作递送载体或结构稳定剂。这些化合物不直接引起抗氧化反应，但通过将生物活性化学物质递送到特定位置、稳定质膜或间接增强天然抗氧化酶（如GPx和SOD）的活性来提高精子保存。因此，它们的保护效果更依赖于其携带的生物活性货物或调节的细胞通路，而非某些固有酶特性。

第二类由具有固有酶样活性的纳米酶组成；它们能够直接调节氧化应激而无需外源抗氧化剂。它们可以是促氧化或抗氧化催化剂。硒纳米颗粒（selenium nanoparticles, SeNPs）模拟GPx和硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase, TrxR）等硒酶。二氧化铈纳米颗粒（cerium oxide nanoparticles, CeO₂-NPs）通过Ce³⁺/Ce⁴⁺循环模拟包括SOD、CAT和过氧化物酶在内的多种酶。同样，ZnO和锌基纳米颗粒协助抗氧化防御、增强CAT活性并提高内源性SOD。TiO₂纳米颗粒、金纳米颗粒（gold nanoparticles, AuNPs）和银纳米颗粒（AgNPs）也具有固有纳米酶活性，但TiO₂纳米颗粒以及在某些情况下的AuNPs和AgNPs也可能由于其促氧化或情境依赖性催化作用支持ROS的形成。这可能对精子功能产生不利影响。

现有数据表明纳米材料具有两种情境特异性效应。一些纳米材料能够复制抗氧化酶如SOD和CAT，或诱导GPx等内源性防御，从而降低ROS水平并增强精子活力、膜完整性和DNA稳定性。另一方面，一些纳米材料——包括CeO₂、ZnO、MnO₂、Mn₃O₄、SiO₂、氧化铁（IO）、碳（C）、金（Au）、银（Ag）和姜黄素（Cur）——即使在相对低剂量或短期暴露后也已在人和小鼠中发现引起生殖和遗传毒性。这些不利影响的程度将取决于多种物理化学参数，如材料组成、粒径、表面性质、剂量和暴露时间。表面功能化，如抗氧化剂负载和聚合物包覆，可以极大地帮助调节这些后果。值得注意的是，大量毒性数据来自环境暴露或高剂量情况的文献，这与精子冷冻保存研究中纳米颗粒的受控、低剂量暴露不直接相关。研究表明，在生物学相关水平使用的纳米颗粒对牛精子未造成明显毒性。然而，纳米颗粒在牛精子冷冻保存中获得的令人鼓舞的结果必须谨慎对待。严格的剂量优化、应用表面改性措施以减少细胞毒性效应以及广泛的遗传毒性评估是在商业育种项目中安全应用这些材料的必要条件。

5.5 线粒体靶向抗氧化剂

线粒体是精子中ROS的主要来源，使线粒体靶向抗氧化剂成为改善冷冻保存结果的有前景的方法。Mitoquinone（MitoQ），一种与三苯基膦缀合的辅酶Q10衍生物，选择性在线粒体中积累并减少氧化应激，从而改善冷冻保存公牛精子的活力、膜完整性和线粒体活性。一项研究调查了在精液稀释剂中添加不同浓度MitoQ（5、50、500和1000 nM）对荷斯坦公牛精子解冻后质量的影响。结果显示，MitoQ补充，特别是50和500 nM浓度，显著改善精子活力、膜完整性、线粒体活性和存活率。此外，MitoQ有效降低MDA水平和ROS浓度，表明其在冷冻保存过程中缓解氧化应激的潜力。这一发现表明，将抗氧化剂直接靶向线粒体提供了预防ROS积累、保存生物能量学和改善解冻后精子功能的更有效策略。

与线粒体靶向抗氧化剂和其他抗氧化技术的比较中，严格的比较分析非常重要。常规抗氧化剂如维生素E、维生素C和谷胱甘肽在细胞外或细胞质环境中中和ROS，不特异性靶向线粒体——精子细胞中ROS产生的主要位置。另一方面，MitoQ和MitoTEMPO是线粒体靶向化合物，可利用线粒体膜电位（约?180 mV）在线粒体基质中积累数百倍。这种特异性亚细胞定位，而非单独的药代动力学差异或固抗氧化强度，是它们的主要机制优势。因此，它们在抑制线粒体超氧化物产生、维持线粒体膜电位、维持精子生物能量学方面比相同摩尔浓度的传统抗氧化剂更有效。

5.6 非抗氧化方法

尽管抗氧化方法主要对抗ROS的影响，非抗氧化方法旨在降低细胞应激源头处ROS的产生，而非直接消除这些自由基。近来，更多注意力已给予纳米颗粒和植物性抗氧化剂等更复杂的方法。因此，本节仅简要讨论最重要的非抗氧化技术。

能量底物，包括葡萄糖、果糖和丙酮酸，是一些最古老和最常用的非抗氧化策略，已掺入公牛精液稀释剂以解决精子在平衡和解冻后条件下的代谢需求。公牛稀释剂中最常见的膜稳定剂是蛋黄和大豆（大豆）卵磷脂，它们与动物基和非动物基稀释剂的比较研究中改善了解冻后活力和膜完整性相关。值得注意的是，最新发现表明，蛋黄血浆（EYP）而非全蛋黄改善精子保护，因为EYP提供更优的膜稳定并最大程度减少 cryo诱导ROS形成的能力，并去除一些可能对精子活动产生不利影响的脂蛋白或颗粒。

用胆固醇负载环糊精（cholesterol-loaded cyclodextrin, CLC）预处理大豆卵磷脂稀释剂已被证明可提高解冻后活力、膜活性和顶体完整性，这与冷休克抗性一致。它还提高精子膜中的胆固醇含量。

维持精子操作期间的氧张力，特别是在低氧状态下，可以减少ROS的过量产生，因为氧气可用性通常是ROS通过氧依赖性代谢活动（特别是线粒体活动）产生的直接结果。稀释剂中降低的溶解氧水平通过减少ROS产生来最小化氧化应激，从而在冷冻保存过程中改善精子质量。

除氧气控制外，精液样本本身的细胞组成也是ROS负荷的主要决定因素。形态异常和未成熟的精子，特别是具有过多细胞质残留的精子，是ROS的主要来源。通过选择技术如上游法或密度梯度离心去除缺陷或死精子也有助于降低总体ROS水平。上游法、密度梯度离心和微流控技术的精液分选有助于选择具有更高活力、更高DNA完整性以及较少有害ROS分子产生的健康精子。

适当控制精浆，如部分去除或受控稀释精浆，可降低促氧化因子的发生。精浆的抗氧化防御和细胞外囊泡调节精子的ROS平衡。然而，冷藏程序前用精浆预处理可提高精子质量，降低解冻后ROS产生，并改善山羊冷冻精液的受精能力。

牛精子冷冻保存过程中ROS产生的另一个重要但相对被忽视的原因是渗透应激。渗透性冷冻保护剂（特别是甘油）的引入和消除导致精子快速渗透变化，损伤膜稳定性并引发自由基形成。冷冻保护剂的影响通常通过精子细胞与渗透性精子细胞如甘油或DMSO的逐渐平衡来减少。逐渐引入使精子逐渐适应变化并防止体积的巨大变化。然而，高剂量或快速暴露于冷冻保护剂可能具有毒性和膜去稳定作用。甘油可通过毒性、化学和渗透机制引起精子膜脂质结构的病理变化。

为解决这些累积的冷冻损伤来源，最终需要对实际冷冻程序进行精确控制。在正常的精液冷冻过程中，精子的冷却速率不受调控，这使它们面临更高的细胞内冰晶、渗透应激和氧化损伤风险。为解决这些限制，更复杂的冷冻方法如程序控温冷冻仪和玻璃化工艺已设计用于在冷冻保存过程中更精确地控制温度降低。研究人员调查了冷冻仪和细管定位对公牛精子解冻后质量的影响，发现冷冻仪类型对解冻后公牛精子质量有显著影响，TurboFreezer M在总活力和顶体完整精子方面达到最佳值，但细管位置（顶部、中部和底部）没有显著质量影响。玻璃化技术也因其高冷却速率和最大程度减少精子细胞物理损伤而受欢迎。与传统慢速冷冻方法相比，玻璃化可用于去除细胞中冰晶引起的损伤。