生物活性胶原肽的制备、鉴定及其多靶点抗光老化机制研究

《Collagen and Leather》：Preparation, identification, and multi-target anti-photoaging mechanisms of bioactive collagen peptides

　　

本研究旨在从猪皮中鉴定抗光老化肽，并利用理化性质预测、分子对接（MD）、细胞实验及网络药理学（NP）阐明其生物活性机制。研究人员通过超滤（UF）、凝胶色谱（GC）及多通路分子对接，从猪皮肤水解物中鉴定出四种胶原蛋白肽。其中，FGPYGF和GPPSGGFG在400 μM浓度下分别将中波紫外线（UVB）损伤的人永生化角质形成细胞（HaCaT）存活率提升至72.15%和66.36%，并在200 μM浓度下有效抑制细胞衰老。分子对接显示，两种生物活性肽与四种靶酶——基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、核因子κB（NF-κB）和白细胞介素-1β（IL-1β）——形成复合物时，通过氢键、离子相互作用和π-π堆积产生协同且更强的结合作用，结合能从?8.34到?18.37 kcal/mol不等。FGPYGF可抑制MMP-1表达并促进I型胶原蛋白合成，而GPPSGGFG显著降低活性氧（ROS）水平。FGPYGF通过靶向肿瘤坏死因子信号通路（TNF）和胶原分解代谢过程（IL1B/MMP9/2）阻断炎症和基质降解，而GPPSGGFG则通过FoxO/PI3K-Akt通路（CCND1/SIRT1）延缓细胞周期进程并增强抗氧化能力。该研究证实，跨通路调控的多靶点干预可显著增强光保护作用，为抗光老化肽的合理设计和精准应用提供了理论基础。

皮肤作为人体重要的屏障器官，由表皮和真皮共同构成。内源性老化虽不可逆，但由紫外线（UV）辐射驱动的外源性老化——即光老化——仍是重要的治疗靶点。光老化主要体现为细胞外基质（ECM）降解，尤以胶原蛋白和弹性蛋白耗损为特征，进而导致皮肤弹性下降与保湿功能受损。虽然补充胶原蛋白被认为具有抗光老化潜力，但其高分子量限制了生物利用度。相比之下，分子量小于3 kDa的胶原源性生物活性肽吸收效率更高，兼具抗氧化、抗炎及ECM保护等多重活性，因此被视为前景良好的光保护剂。然而，酶解产物本质上是肽片段与残留蛋白质的异质性混合物，必须经过严格纯化才能获得功能活性肽。当前筛选策略多以单靶点筛选为主，但光老化是一个涉及多靶点、多通路的复杂过程：UVB可激活MAPK通路促进基质金属蛋白酶（MMPs）表达并降解胶原，同时通过NF-κB通路诱导炎症反应，甚至在严重暴露下触发凋亡信号，损伤正常皮肤细胞结构与功能。因此，单靶点策略难以全面覆盖光老化的病理网络。此外，现有研究多聚焦于光保护肽的分离筛选，而对不同肽序列间活性差异的分子机制关注不足。阐明这些机制有助于锁定关键靶点与通路，为优化设计高效抗光老化肽提供理论依据。猪皮是丰富、廉价且资源广泛的胶原蛋白来源，其氨基酸组成和结构与人皮肤胶原蛋白相似，在安全性与功效性方面具有优势。基于此，研究人员开发了整合超滤、色谱分离与LC-MS/MS测序的组合策略，对猪皮肤胶原蛋白水解物（PSCHs）进行表征，并通过针对MAPK/NF-κB通路关键节点（MMP-1、MMP-9、NF-κB和IL-1β）的多靶点分子对接筛选候选肽，继而在UVB照射的人永生化角质形成细胞（HaCaT）模型中验证其光保护效果，并结合网络药理学解析协同机制。该论文发表于《Collagen and Leather》。

研究人员采用的关键技术路线可概括为：利用超滤离心和Sephadex G-25凝胶色谱对PSCHs进行分离纯化，结合LC-MS/MS与Peaks数据库鉴定肽段序列，借助PeptideRanker计算生物活性评分；通过AutoDock Vina将候选肽与MMP-1、MMP-9、NF-κB及IL-1β进行多靶点分子对接；以UVB（40 mJ/cm²）诱导HaCaT细胞光老化模型，采用CCK-8、SA-β-gal染色、DCFH-DA荧光探针及ELISA分别评估细胞活力、衰老程度、活性氧（ROS）水平以及MMP-1和I型胶原蛋白含量；并运用Swiss Target Prediction、GeneCards、STRING等数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，开展基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。

研究结果部分，PSCHs分级组分的光保护活性分析显示，通过超滤分离得到的U1（<1 kDa）和U2（1–3 kDa）组分可在400 μg/mL浓度下显著提高UVB损伤HaCaT细胞的存活率，分别达到68.69%和63.35%，而U3和U4无显著改善；选择活性最佳的U1经Sephadex G-25进一步分离后，G4组分在200 μg/mL时显示出最强的细胞存活率提升效果（76.51%），且对照实验证实该活性并非源于高甘氨酸含量的非特异性效应，而是由特定肽序列介导。肽序列鉴定与筛选结果显示，G4组分经LC-MS/MS共鉴定出107条肽序列，分子量范围为249.14–1057.54 Da，肽链长度4–21个氨基酸，其中四肽和五肽占比达49.54%；经PeptideRanker以0.85为阈值筛选后，最终获得51条潜在光保护肽。分子对接结果揭示，FGPYGF表现出优越的多通路靶向能力，对MMP-1结合能最低（?9.70 kcal/mol），并通过与Ala-182、Glu-219、Leu-181形成三个氢键以及与催化锌离子直接配位；GPPSGGFG则对MMP-9（?10.06 kcal/mol）和NF-κB（?9.20 kcal/mol）具有最强亲和力，可占据MMP-9底物结合口袋并阻断NF-κB DNA结合域；QPPGP和FGPY分别被选为NF-κB通路和MAPK通路的单靶点对照肽。肽对HaCaT细胞的效应显示，除高浓度外四种肽均无明显细胞毒性，FGPYGF和GPPSGGFG在400 μM时显著提高UVB损伤细胞的存活率，优于单靶点对照肽，该差异可能与FGPYGF更高的疏水性有利于跨膜渗透有关。肽对光老化HaCaT细胞衰老的影响显示，UVB照射使SA-β-gal阳性细胞比例显著升高，而200 μM肽处理均可降低衰老标志，FGPYGF抑制效果最强。肽对HaCaT细胞ROS产生的影响显示，UVB显著升高ROS水平，四种肽均能降低荧光强度，其中GPPSGGFG清除ROS效果最为显著。肽对HaCaT细胞MMP-1和I型胶原蛋白含量的影响显示，UVB显著上调MMP-1并下调I型胶原蛋白，FGPYGF最显著抑制MMP-1并促进I型胶原蛋白合成，GPPSGGFG也能显著提升I型胶原蛋白水平。光老化相关靶点鉴定与PPI网络构建显示，FGPYGF与45个光老化相关靶点重叠，主要涉及炎症信号和基质降解通路；GPPSGGFG与39个靶点重叠，主要涉及炎症、氧化应激和细胞周期调控；两者共享STAT3、PTGS2、SRC等靶点，提示存在重叠抗炎机制。GO和KEGG通路功能富集分析进一步显示，FGPYGF主要通过TNF信号通路和胶原分解代谢过程发挥急性抗炎与抗基质降解作用，而GPPSGGFG主要通过FoxO/PI3K-Akt通路调控细胞周期进程并增强抗氧化能力。

讨论部分总结来看，FGPYGF和GPPSGGFG通过差异化的多靶点机制产生协同光保护效应。FGPYGF靶向TNF信号通路和胶原分解代谢过程（IL1B/MMP9/2），可快速阻断炎症级联和胶原酶活性，从而修复急性光损伤；GPPSGGFG则通过FoxO/PI3K-Akt通路（CCND1/SIRT1）延缓细胞周期进程并增强抗氧化能力，从而延缓慢性光老化。共享靶点的存在使两种肽形成功能互补的“抗炎修复”与“抗衰老代谢调控”协同模式。

研究结论指出，该研究通过超滤、凝胶色谱和分子对接从PSCHs中鉴定出四种胶原衍生肽。细胞实验证实，多靶点肽（FGPYGF和GPPSGGFG）较单靶点肽（QPPGP和FGPY）表现出更优的光保护效果。在400 μM浓度下，FGPYGF和GPPSGGFG将UVB损伤HaCaT细胞存活率分别提升至72.15%和66.36%（P < 0.01），并在200 μM浓度下显著抑制细胞衰老。FGPYGF特异性抑制MMP-1表达（P < 0.001）并促进I型胶原蛋白合成（P < 0.01），而GPPSGGFG显著降低ROS水平（P < 0.001）。网络药理学揭示，FGPYGF通过靶向TNF信号通路和基质降解通路（经IL1B/MMP9/2）直接阻断炎症级联和胶原酶活性以修复急性光损伤；GPPSGGFG通过FoxO/PI3K-Akt抗氧化通路（经CCND1/SIRT1）调控细胞周期阻滞，通过代谢稳态延缓慢性光老化。共享靶点（STAT3/PTGS2）提示两者存在重叠抗炎机制，形成“抗炎修复”与“抗衰老代谢调控”的协同模式。这些发现验证了跨通路调控的多靶点干预可增强光保护功效，并通过“分离-对接-验证”筛选平台为抗光老化肽的合理设计和精准应用建立了理论框架。