《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Single-cell mass spectrometry imaging: platform advances for multimodal spatial omics
空间组学通过揭示生物系统的分子特征并保留空间背景，已经彻底改变了生物医学研究。在这些方法中，质谱成像（MSI）提供了一种无标记、原位的多样化分子类别可视化手段，包括代谢物、脂质、蛋白质和聚糖。仪器、样本制备和数据采集方面的最新进展已将MSI推向单细胞分析领域，为不同生物背景下的细胞异质性和分子状态提供了前所未有的研究途径。在此，研究人员综述了当前单细胞MSI平台，并强调了在提高空间分辨率、灵敏度和通量方面的关键创新。已发表工作流程中的示例展示了细胞分离、捕获和数据采集策略的多样性。解吸电喷雾电离（DESI）、二次离子质谱（SIMS）和基质辅助激光解吸电离（MALDI）这三种主要离子化技术因其生成稳健的单细胞多组学分析能力而受到关注。研究人员概述了该领域的未来方向以及单细胞MSI影响转化空间组学研究和精准医学的潜力。
引言
空间组学作为生物医学研究领域 transformative 的方法论，为理解复杂生物过程和疾病进展背后的分子异质性提供了关键洞见。在空间组学方法中，质谱成像（MSI）是原位可视化分子组成的强大技术。MSI 保留了样本的原始分子结构，并在生物标本上采集质谱以生成高分辨率的离子强度图，从而实现特定生物分子空间分布的直接可视化。此外，工作流程优化显著提升了分析灵敏度和可重复性，促进了蛋白质、代谢物、脂质和聚糖等关键分子类别的稳健连续多组学分析。
MSI 虽然在空间组学中已成为强有力的模态，但需要将其置于更广泛的基于质谱的单细胞分析技术背景中加以定位，这些技术各具优势与局限。单细胞 MSI 技术通常能够达到亚细胞空间分辨率、高灵敏度代谢物检测和多路蛋白定量等能力，但这些技术在空间保真度、分子覆盖范围、灵敏度和样本保存性之间存在根本性的平衡差异。因此，MSI 应被视为细胞尺度空间分辨分子分析的若干新兴策略之一，而非唯一解决方案。全面理解这些权衡对于选择合适平台以及在空间和系统生物学更广泛背景下解读单细胞数据至关重要。
目前有三种主要 MSI 离子化源用于获取高分辨率单细胞数据：二次离子质谱（SIMS）、基质辅助激光解吸/电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）。这些代表了空间分辨质谱方法中既相互区别又互补的策略，各自具有独特的技术优势和实际权衡。SIMS 是最早达到亚细胞分辨率的方法，MSI 领域的先驱者利用其绘制了单个神经元和细胞膜内的小分子和脂质图谱。MALDI 用于组织 MSI 分析首次报道于1997年。直至2010年前后，大多数 MALDI-MSI 研究通常使用100–200 μm 的空间分辨率，受限于仪器和软件条件，且基质应用选择有限、采集时间长。随后的16年中，仪器、软件和样本制备的重大进步使商业仪器能够常规达到5 μm 空间分辨率，而先进的研究型仪器可在单细胞水平达到1 μm 及更低分辨率。MALDI-MSI 的进一步发展采用小于细胞本身的激光微探针，实现了亚细胞和细胞内环境的 distinct 化学和生物学映射。
在后续章节中，研究人员综述单细胞 MSI 的最新创新，重点介绍样本制备、采集方法以及数据处理和分析中的新兴策略。MSI 是目前实现细胞尺度空间分辨分子分析的若干质谱平台之一；通过综述这些平台的当前进展，旨在提供方法演变的概述，同时突出 MALDI-MSI 相对于其他方法的独特优势，包括其可重复性、灵敏度和可扩展性。最后预测该领域的未来方向，重点强调这些平台在分析循环细胞标志物方面的应用。
单细胞 MSI 技术
随着基于 MSI 的技术进步，越来越多的关注转向将这些平台适配于直接单细胞分析。然而，实现这一分辨率水平需要能够在保持足够灵敏度的同时保留空间保真度的策略。基于单细胞的 MS 分析可根据检测策略、组分分析和成像分析等特征分为不同类别。
SIMS 能够实现横向分辨率低至30–50 nm 的细胞成像，同时保持单细胞成像的高空间分辨率。该仪器使用连续聚焦离子束通过溅射从样本表面移除材料。SIMS 常与飞行时间（TOF）质量分析器联用，使相同能量但不同质量的离子通过飞行时间分离，最终提高灵敏度和质量范围。TOF-SIMS 首次用于单细胞原生动物中小分子化合物的成像。TOF-SIMS 的进一步进步，如引入 Orbitrap 质谱仪，即所谓的3D OrbiSIMS，也已证明可提高至单细胞水平的质量分辨率和准确度。尽管多种工作流程展示了 Orbitrap 在细胞水平上的 MSI 能力，但该工作流程因采集时间长而通量低，例如仅有少于20个细胞被检测。其他 SIMS 技术如纳米尺度二次离子质谱（NanoSIMS）方法也用于单细胞方法，这些通常需要使用同位素或抗体标记进行分析。
使用金属偶联标签进行成像在 interrogating 复杂组织中的细胞表型和微环境相互作用方面显示出强大能力，包括肿瘤中的免疫细胞浸润和空间组织的生态位。这些方法达到亚微米分辨率，能够精确将蛋白质定位到细胞膜、细胞核等细胞区室，并提供其他相邻成像方法难以解析的细胞-细胞相互作用和功能状态的洞见。由于金属同位素不受光漂白或自发荧光影响，长采集时间内的高信号稳定性允许大面积的一致定量。
金属标记方法的另一个优势是其通过抗体固有的靶向性，允许对特定细胞群体进行聚焦的空间分析。尽管这需要预先了解相关标志物，但经验证的抗体面板可用于细胞和形态组成分析，从而在单细胞空间组学领域占据关键生态位，并可与无靶向 MSI 数据集整合。新兴的多模态工作流程越来越多地将基于金属标记的免疫表型分析与 MALDI-MSI 或其他空间代谢组学平台相结合，实现细胞身份与内源分子状态的直接对齐，强化这些工具作为互补方法而非全面单细胞空间分析独立解决方案的价值。
多路离子束成像（MIBI）代表了一类 distinct 但高度互补的单细胞空间分析，将基于 SIMS 的方法扩展至靶向的、抗体驱动的蛋白质组映射。与传统 SIMS 或 NanoSIMS 主要关注内源离子或同位素标记代谢物的工作流程不同，MIBI 利用与稳定金属同位素偶联的抗体，实现单组织切片或细胞群体中蛋白质的高多路复用定量成像，达到亚细胞分辨率。初级离子束在样本表面光栅扫描，释放的金属标签随后由飞行时间质谱作为二级离子检测。由于每个抗体标记有独特的金属同位素，MIBI 避免了荧光成像中常见的光谱重叠，可同时检测单个组织切片或细胞群体中的40–50个蛋白靶点。
基于金属标签的成像方法如飞行时间细胞术（CyTOF）、成像质谱流式（IMC）和 MIBI 是组织中单细胞多路分析广泛使用的平台。CyTOF 有效地将电感耦合等离子体电离与飞行时间质谱相结合，定量与纯同位素重金属标签偶联的抗体。IMC 将 CyTOF 原理扩展至组织切片，以在亚细胞分辨率下保留空间背景。由于每个金属同位素占据具有最小光谱重叠的离散质量通道，这些方法可实现每个细胞约40–60种蛋白标志物的高灵敏度同时定量。这些工作流程中的细胞分辨率通过完整细胞结构在保留的组织架构内的分割实现，而非仅依赖像素尺寸的减小。这些结果使特定邻域分析成为可能，可对各种免疫细胞在微环境中的相互作用进行稳健映射，使 IMC 模态在空间免疫学和肿瘤微环境研究中得到广泛采用。类似的方法如 MIBI 也采用这种金属同位素标记抗体方法，但将其与基于离子束的解吸附和 SIMS 相结合。此外，与 TOF 分析器联用，MIBI 实现了高通量且高度多路的亚细胞成像，且不牺牲灵敏度。另外，荧光原位杂交（FISH）SIMS 是另一种利用相关显微镜进行单细胞成像分析的混合靶向技术。
此外，还有使用 SIMS 模态实现高灵敏度的无标记、非靶向技术。由于其高真空要求和生物分子的低电离效率，SIMS 技术可实现亚微米空间分辨率，用于各种元素分析、同位素示踪实验以及某些脂质和代谢物类别的检测。对于 TOF-SIMS，每个像素点获取完整的质谱，从而实现多种分子类别的空间映射。这些方法高度灵敏，TOF-SIMS 已被广泛应用于药物递送示踪及各种多组学分析工作流程。
基于 ESI 的成像技术也用于单细胞 MSI，最广泛使用的方法是 DESI-MSI，这是一种喷雾式电离方法，将带电溶剂施加到样本表面，离子束解吸和电离分析物分子。然而，这些液滴太大，无法使用标准 DESI 分辨单个细胞，因此纳米喷雾解吸电喷雾电离（nano-DESI）通过使用次级毛细管输送解吸的分析物以实现单细胞分析。其他近期发表的 DESI 平台包括超低流速解吸电喷雾电离质谱成像（u-DESI-MSI），利用溶剂流速的显著降低在样本表面产生聚焦的喷雾点，从而形成更小的"像素"尺寸以实现亚细胞分辨率。多个研究组已证明 nano-DESI 的代谢组学和脂质组学单细胞能力；然而，这些方法显示其通量和灵敏度有限。此外，激光消融电喷雾电离（LAESI）是一种基于 ESI 的技术，涉及使用红外（IR）激光从表面消融分子，尽管通量较低，每小时仅能捕获约100个细胞，目前工作正集中于实现单细胞分析所需的灵敏度。预期涉及微流控平台、基于液滴的样本处理和微尺度色谱的 ESI 持续进步将有助于克服当前通量瓶颈，实现高分辨率、高灵敏度的结果。
过去25年中，MALDI-MSI 在单细胞空间组分析背景下经历了显著增长。MALDI 涉及将有机化学基质直接应用于样本以辅助激光解吸生物分子的电离。基质有助于从脉冲激光束到样本的能量转移过程，辐照时基质吸收激光能量并将其转移至周围的分析物，使其解吸进入气相。基质与嵌入式生物分子之间的反应促进软电离，以最小碎片化的方式生成完整的分子离子。该方法允许靶向动态质量范围，同时实现低至1–5 μm 的横向分辨率，以进行灵敏、高分辨率原位分析。最初，通过 MALDI-MSI 实现单细胞分析的方法使用附着在载玻片上的培养细胞，使单个细胞能够被空间隔离并均匀包裹基质以进行准确的单细胞 interrogation。例如，可重复的低密度细胞培养阵列已证明能够以高灵敏度鉴定复杂 N-聚糖，并将其与单个细胞共注册。IDAWG（aminosugars with glutamine 的同位素检测）方法通过将重氮标签直接整合到细胞 aminosugars 中，实现 N-聚糖周转率和合成动力学的精确测量。
MALDI-MSI 因其获取非靶向、高度特异性多组信息的能力同时优先保证样本处理效率，在单细胞分子分析领域得到广泛应用。Li 等研究人员已证明可在单细胞尺度进行可重复的单细胞代谢组学和脂质组学分析。其他研究人员通过将 MALDI 与各种技术联用展示了单细胞分辨率能力，如免疫组织化学（MALDI-IHC），引入了该平台的多重能力。MALDI 成像的最新发展包括初始解吸后添加第二激光的 MALDI-2。次级电离也被证明是单细胞分析的有前景技术，因为它允许检测更广泛的分子以及浓度更低的分子。借助 MALDI-2，过采样技术也被证明可增强低强度样本和低丰度物种的可检测性。仪器的其他变体包括对大气压 MALDI（AP-MALDI）的使用，与传统 MALDI 不同，其在开放空气中而非真空下发生，通常简化了样本制备和处理。透射式 MALDI（t-MALDI）旨在通过采用"穿透样本"几何结构提高横向分辨率，即激光通过载玻片基底的背面聚焦而非正面，从而实现更高数值孔径光学和更小的消融坑。最近，t-MALDI 与激光后电离（MALDI-2）的组合在组织切片中提高了灵敏度同时保持 <1 μm 分辨率，可检测多达200种脂质和核苷酸。补充这些技术的策略包括双极性 MALDI，其在相同坐标点同时以正负离子模式采集数据，以捕获具有不同电离倾向的脂质和代谢物。近期工作表明，双极性采集特别在与离子淌度或捕集离子分离联用时，可在细胞分辨率下增加检测到的脂质种类数量，无需重复基质涂覆。
单细胞质谱成像中的权衡
在 MSI 领域，跨成像模态实现单细胞分辨率需要平衡样本制备、电离效率和分子覆盖范围。此外，由于每个平台都有其独特的工作流程和采集方法，存在与分辨率-灵敏度相关的根本性权衡。对单细胞 MSI 数据的严格解读因此需要评估离子产率、可检测分析物数量和工作流程可行性。对于单细胞 MALDI-MSI，随着像素和激光光点尺寸减小，采样面积和随之解吸/电离的分子总数减少，离子计数可能低于检测阈值。由于定量稳健性降低，区分生物学异质性与技术性噪声变得具有挑战性，在不降低分辨率的情况下缓解灵敏度的策略包括使用小于激光光点直径的激光步长，以及 MALDI-2 等后电离方法。所用化学基质的选择及其在样本上的应用方式也是考虑因素。
在 MALDI 工作流程中，专注于 N-聚糖、脂质和代谢物等各种分子类别分析时，存在额外的样本制备和分析挑战。释放 N-聚糖的分析需要直接的酶促消化，这可能引入效率和空间定位的可变性。类似地，脂质和代谢物的检测对基质选择和应用高度敏感，这些单细胞平台中的离子抑制仍然是一个挑战。这些因素共同凸显了标准化样本制备方案、适当参考材料和谨慎标准化策略以提高定量可靠性的必要性。
基于 SIMS 的成像通过高度聚焦的离子束实现亚微米范围的高空间分辨率和灵敏度，但代价是采样体积较小和碎片化限制。Orbitrap-SIMS 或 NanoSIMS 等最新进展提高了分子特异性和检测能力，但灵敏度仍与电离效率紧密相关，与 MALDI-MSI 类似。相关光和电子显微镜-SIMS（CLEM-SIMS）将 SIMS 模态与透射电子显微镜的超微结构成像相整合，实现纳米尺度的细胞器和膜结构背景同时获取化学或同位素组成数据。
基于 ESI 的单细胞方法提高了低丰度物种如代谢物和脂质的细胞检测灵敏度；然而，这通常以空间结构损失和通量降低为代价。DESI-MSI 空间分辨率的改进包括使用 nano-DESI 配合显微镜辅助达到十微米分辨率。其他技术如 DEFFI、STC-DESI、u-DESI 和 t-SPESI 共享局部溶剂介导提取分析物后接电喷雾电离的共同原理。与 MALDI 或 SIMS 不同，这些方法在环境条件下运行，避免基质沉积或高能溅射，可更好地保存代谢物。DESI 工作流程的权衡在于其工作流程，因为减小溶剂相互作用面积会减少总提取物质，但这被相对较高的电离效率所抵消。
靶向成像平台包括 IMC 和 MIBI，在保留组织结构的同时达到高灵敏度和 ~1 μm 分辨率。灵敏度由表位丰度和抗体结合控制，而非内源分子浓度，从而实现稳健的单细胞定量。IMC 的光学免疫组织化学在于其高多重化能力，已显示更高的灵敏度、特异性和可行性，但这些方法限于预定义的蛋白靶点且需要固定组织切片，限制了其对悬浮和体外分析的适用性。
细胞捕获和样本制备技术
样本制备是单细胞 MSI 的关键组成部分，因为数据质量高度依赖通量、灵敏度、可重复性和细胞完整性等关键要素。单细胞分离和样本制备是高度复杂且多层次的过程，已发表技术中的工作流程设计差异显著。细胞分离方法包括低密度直接培养于载玻片上、微阵列、激光捕获显微切割（LCM）、毛细管取样和荧光引导技术等。
对于 MALDI、DESI 和 SIMS 方法，最常见的技术之一是直接于导电 ITO 涂层载玻片上进行低密度培养。在此方法中，细胞稀疏接种以确保物理分离，并在固定或基质应用前允许贴附。改善细胞贴附一致性的方法之一是使用预定义的微图案化基底阵列，将细胞粘附限制在确定位置。对于每个细胞，目标是提取单个代表性质谱，通过组合对应于该细胞物理位置的所有图像像素的信号。这可以手动通过视觉选择像素完成，或更系统性地通过将 MSI 数据与同一区域的显微镜图像共注册完成。
当前单细胞 MSI 采集方法
单细胞 MSI 工作流程凸显了光学图像引导细胞分割并将其转移到 MS 图像上的必要性。与大面积组织检测的 bulk MSI 不同，单细胞工作流程必须将每个分子谱分配给特定的、视觉定义的细胞。光学与 MS 成像数据采集之间的映射是将谱分配给单个细胞的技术挑战，对精确准确的空间成像至关重要。两种主要策略应运而生：前端坐标采集和后端基于图像的注册。
基于显微镜的共注册是前端坐标采集的最常用方法。这涉及靶向细胞的光学或荧光显微镜检查，随后进行计算注册以对齐光学和 MS 坐标系。SpaceM 等方法通过在高分辨率光学图像 prior to 基质沉积和 MALDI 分析前获取细胞培养的高分辨率光学图像，然后记录显示激光消融痕迹的后采集图像来实现这一目标。两幅图像对齐以提取对应于每个分割细胞的谱。这种多模态对齐使得直接从贴壁培养物进行单细胞代谢组学或脂质组学分析成为可能，并已在"HT-SpaceM"平台中规模化。类似地，PRISM-MS 引入了"质谱引导"方法，其中低分辨率预扫描识别含细胞像素，随后的高分辨率扫描聚焦于这些位置，显著提高通量和数据质量。
图像共注册技术主要依赖细胞直接贴附于载玻片，这可能限制对弱贴附细胞类型的应用，并排除非贴附的悬浮细胞类型如循环免疫细胞。基于坐标的阵列方法已被开发用于捕获和索引悬浮及培养贴壁细胞于固定位置。这些平台代表了该领域的转化性转变，特别 enable 非贴附群体的分析，并为临床前筛选分析和个性化医学建立了坚实基础。
在基于坐标的方法中，每个单独细胞的位置在 MSI 实验前确定。例如，Dressman 等研究人员近期报道的工作流程将单个细胞捕获于预定义的网格位置并在 MALDI 成像前记录其坐标。通过预先知道细胞位置，每次激光射击可精确靶向，避免相邻细胞之间的混合消融，消除事后图像对齐的需要。这种前端方法 advantageous for 分布良好的细胞或微阵列样本，因为它简化了下游数据分析并允许谱直接与细胞元数据如表型或实验条件关联。此外，预成像允许在这些载玻片上进行多组学方法，实现连续重复分析以获取每个识别细胞的完整代谢图谱。
无论选择何种采集方法，单细胞 MSI 产生的海量数据很快超出人工解读的能力。因此，专用软件和计算分析框架对数据处理、归一化和特征提取变得必不可少。SCiLS Lab、Cardinal（R/Bioconductor）、METASPACE 或基于 Python 的流程等平台已被用于执行单细胞分辨率的光谱提取、归一化和聚类分析。为解读这些数据集，许多研究组正在整合机器学习（ML）和人工智能（AI）方法。例如，DATSIGMA 框架最近被提出作为处理和分析图像引导单细胞 MS 数据的开源、数据驱动和机器学习工作流程。该框架旨在增强特征提取和可解释性，凸显了开发标准化流程以提高可重复性的关键趋势。
结论与未来机遇
空间转录组学和多路空间蛋白质组学领域过去五年的重大进展揭示了单细胞水平分析对基础生物学和疾病过程的影响。最适合 MSI 检测的分子在生物合成上是非模板化的，与靶向转录组学和蛋白质组学方法在同一组织/细胞上进行时提供协同数据。MSI 仪器和技术的最新进步对于发现独特细胞状态和异质细胞群体内的细微分子差异至关重要。用这些平台实现单细胞分辨率允许以前所未有的水平解决生理和病理学问题，揭示先前被组织水平平均所掩盖的新见解。
MALDI-MSI 在空间单细胞分析方面提供了多种选择，包括稳健性、通量和灵敏度方面。此外，使用 MALDI-MSI 配合细胞捕获阵列允许多组学分析，实现对数千个单个细胞的脂质、代谢物、肽和聚糖的检测。这些单细胞阵列也应可适配于 SIMS 和 DESI-MSI 应用，提供每种电离平台固有的分析物检测优势。单细胞 MSI 的全部潜力仍取决于克服样本制备和数据处理中的变异性等显著障碍。这些高分辨率技术产生高维数据集，凸显了专用软件和稳健计算算法的必要性，该领域继续向机器学习等分析策略和空间统计学的进步以揭示复杂的空间和分子模式发展。
标准化和可重复性仍然是单细胞 MSI 临床和转化应用的关键障碍。由于工作流在仪器、样本制备和数据采集中存在显著变异性，空间分辨率、电离条件和分析物覆盖范围的差异可能导致跨平台分子识别的不一致。建立这些性能指标并确保细胞分辨率的重复性是将单细胞概念验证研究转化为可靠、可扩展且临床可操作的工作流程的关键方向。
单细胞质谱成像代表了一种新兴的空间分辨分子分析方法，每种方法在灵敏度、分辨率和分子覆盖范围方面具有 distinct 的权衡取舍。未来进展将依赖于整合性、多模态策略，利用互补优势以实现对复杂生物系统内细胞异质性的稳健和高通量表征。
