空间转录组学分析揭示小鼠和人类中不同的红细胞生成微环境

《Nature Genetics》：Spatial transcriptomic analyses highlight distinct erythroid niches in mice and humans

　　

红细胞生成需要被称为红细胞生成岛（EBI）的特化微环境，即由中央巨噬细胞 surrounded by 发育中的红系前体细胞组成的有利结构，以完成其成熟过程。然而，对EBI组成和功能的理解受限于二维体外模型的局限以及人类造血组织中EBI组成不明确这两大瓶颈。研究人员利用空间转录组定位技术，在发育期和应激条件下对小鼠和人类的造血组织进行了分析，发现EBI结构具有出乎意料的物种特异性。在小鼠中，C1q表达的巨噬细胞是EBI中央巨噬细胞的标志，并介导排出红系细胞核的清除。然而，在人类中，EBI以胎儿肝脏和骨髓中巨噬细胞非依赖性的红系细胞簇为特征，其完整性关键依赖于黏附分子ICAM4。这些人类红系细胞簇在髓系疾病中受到破坏，但可通过治疗恢复。这些发现重新定义了红细胞生成微环境生物学的传统模型，并建立了跨物种理解微环境动态变化的框架。

研究背景与问题

哺乳动物终末红细胞生成发生在称为红细胞生成岛（EBI）的特化造血微环境中，该结构由中央巨噬细胞 surrounded by 发育中的成红细胞组成。数十年来，主要基于小鼠模型的研究鉴定了EBI巨噬细胞表面的关键分子，包括F4/80、EMP、Vcam-1、αv-整合素、CD163、CD169和EpoR等，这些分子支持红细胞生成。然而，大多数研究依赖于体外二维重建系统，这类系统在分离过程中会破坏EBI结构，无法忠实模拟其体内空间组织。此外，人类EBI的特征和功能研究尚不充分。尽管近期成像技术进步揭示了造血过程的空间特征，包括成红细胞簇与红细胞集落形成单位在血窦附近的物理邻近性，以及激光捕获显微切割偶联测序对骨髓微环境的洞见，但现有方法缺乏对造血过程跨发育阶段和跨物种的全面、无偏倚的空间转录组覆盖。

该研究发表于《Nature Genetics》，首次系统比较了小鼠和人类红细胞生成微环境的架构差异，发现传统用以小鼠为中心的理论模型无法解释人类EBI的组织方式，这对临床转化研究具有重要启示意义。

关键技术方法

研究人员采用10x Genomics Visium平台（Visium V1）进行空间转录组分析，样本涵盖小鼠和人类的多项造血器官，包括小鼠E13.5-E14.5胎儿肝脏、出生后第8天股骨骨髓、2月龄脾脏（含苯肼处理组）、20月龄老年小鼠骨髓，以及人类16周胎龄胎儿肝脏、12周胎龄胎儿肝脏、50岁健康成人骨髓血凝块、MDS患者治疗前后骨髓血凝块。单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析采用Giotto Suite和Seurat软件，整合公开数据库GSE176063、GSE172127、GSE108097、GSE134355、GSE120446及E-MTAB-7407。高分辨率验证采用10x Genomics Xenium平台进行单细胞原位分析，小鼠E14.5胎儿肝脏设计98条定制探针。功能验证实验包括：C1qa基因敲除小鼠骨髓移植、骨髓来源巨噬细胞（BMDM）与成红细胞共培养体系、重组C1q蛋白处理、流式细胞术检测嗜焦性红细胞核（pyrenocyte）；人类诱导多能干细胞（iPS cell）来源骨髓类器官培养及抗体阻断实验（抗ICAM4、抗RHAG、抗αv-整合素）、甲基纤维素集落形成单位（CFU）分析、临床骨髓活检样本免疫荧光及流式细胞术检测。

研究结果

C1q是小鼠胎儿红细胞生成中EBI巨噬细胞的标志

研究人员首先分析了E14.5小鼠胎儿肝脏的空间转录组数据，通过降维和聚类分析鉴定出七个主要细胞群体。空间分布图显示这些簇具有不同的空间定位，提示小鼠胎儿发育期间存在分区化造血。通过与已发表scRNA-seq数据整合分析，发现红细胞和红细胞祖细胞主要位于簇3和4，且与C1q⁺巨噬细胞基因表达谱高度相关，提示其空间相邻性。定量相关分析证实C1q⁺巨噬细胞与红细胞及红细胞祖细胞均呈正相关，表明C1q⁺巨噬细胞更倾向于作为EBI中央巨噬细胞发挥作用。Pathway分析显示C1q⁺巨噬细胞富集血红素代谢、铁供应和回收相关通路。除预期的补体和凝血标志外，C1q⁺巨噬细胞还高表达Vcam1、MerTK、Timd4、Dnase2a（参与红系挤出核的吞噬）、Hmox1、Slc40a1、Trf（铁代谢必需）以及转录因子Spic、Nr1h3、Maf和生长因子Igf1、Il18等已知支持成红细胞发育的分子。Xenium单细胞分辨率分析进一步确认C1q⁺巨噬细胞与红系细胞的强关联性，平均EBI间距为108.35±28.11 μm，每个C1q⁺ EBI平均包含25.1±3.5个红细胞。E13.5胎儿肝脏呈现相似的空间分布，但关联强度较弱，提示C1q⁺巨噬细胞为中心的EBI结构随胎儿红细胞生成进展而强化。

C1q⁺标记小鼠骨髓中的EBI巨噬细胞

为确定C1q是否为小鼠骨髓EBI巨噬细胞的标志，研究人员对出生后第8天小鼠股骨进行空间转录组分析。结果显示红细胞与C1q⁺巨噬细胞共定位，而非其他巨噬细胞。值得注意的是，C1q⁺巨噬细胞还与髓系细胞和中性粒细胞强邻近，与近期报道小鼠骨髓EBI同时支持粒细胞生成相一致。Xenium分析证实C1q⁺巨噬细胞与红细胞形成EBI结构，同时存在巨噬细胞非依赖性红细胞簇。为分析成年骨髓，研究人员改良了无脱钙冷冻切片方案，利用骨与骨髓热膨胀系数差异实现干净分离。20月龄老年小鼠分析显示C1q⁺巨噬细胞与红细胞的相关性弱于新生儿骨髓，提示小鼠EBI结构存在衰老相关性改变。

C1q参与嗜焦性红细胞核的吞噬

多重免疫荧光验证显示，F4/80标记分散的EBI巨噬细胞 surrounded by 成红细胞，偶尔可见嗜焦性红细胞核被中央巨噬细胞吞噬。C1q呈弥漫点状分布，反映其细胞外分泌特性。ViewRNA荧光染色检测到Ter119<sup>+成红细胞围绕的巨噬细胞中C1qa RNA表达。约86.67±18.86%的C1q+ EBI巨噬细胞直接被>5个成红细胞附着。C1q属于经典补体激活途径的C1复合物组分，除补体激活外还具有多种功能。流式细胞术检测显示骨髓中嗜焦性红细胞核的C1q蛋白水平显著高于成红细胞和网织红细胞。共培养实验表明，骨髓来源巨噬细胞与成红细胞共培养显著减少嗜焦性红细胞核数量，添加重组C1q蛋白进一步降低嗜焦性红细胞核。C1qa过表达BMDM减少嗜焦性红细胞核，而Tyrobp过表达无此效果。C1qa敲除小鼠骨髓移植实验显示，受体小鼠年轻年龄时红细胞计数轻度降低，骨髓中嗜焦性红细胞核显著增加。然而，C1qa缺失并未改变胎儿肝脏细胞类型间空间相关性，提示C1q对EBI结构组装并非必需。

人类EBI为巨噬细胞非依赖性红系细胞簇

为系统研究人类EBI体内组成，研究人员对16周胎龄人类胎儿肝脏进行匹配条件下的空间转录组分析。结果显示表达红系特异性基因（HBA2、HBG2）的簇与巨噬细胞特异性簇（SERF1A、SSPP1）空间分离。整合已发表scRNA-seq数据发现红细胞与C1Q+或其他巨噬细胞无空间关联，仅红细胞与红细胞祖细胞呈正相关。Xenium分析同样显示红细胞与红细胞祖细胞邻近，C1Q+巨噬细胞 adjacent 的红细胞存在但不具排他性。人类胎儿肝脏EBI平均直径与小鼠相当，80 μm边界内每个EBI平均含50.45±2.35个成红细胞。12周胎龄胎儿肝脏证实无巨噬细胞-红细胞空间邻近性，但早胚期红细胞-红细胞祖细胞相关性较弱，提示更早胚期红细胞分布更为分散。

针对成人骨髓研究，研究人员采用临床常规制备的骨髓血凝块切片，避免脱钙导致的RNA降解。50岁健康成人分析显示，与胎儿肝脏相比，空间异质性更为显著。与鼠类造血组织相比，人类成人骨髓巨噬细胞数量减少，主要为C1Q+细胞。空间和单细胞整合分析揭示C1Q+巨噬细胞与红细胞及红细胞祖细胞分布不同，而红细胞与红细胞祖细胞密切共分布。Xenium数据证实红系谱系紧密关联，巨噬细胞非依赖性EBI平均大小为80 μm直径内含38.9±3.5个细胞。C1Q+巨噬细胞反而被多种细胞谱系包围，优先与基质细胞和中性粒细胞关联。骨髓核心活检分析确认CD235a+红细胞为主的EBI缺乏中央巨噬细胞，CD68染色显示巨噬细胞标志分布于EBI周边而非内部。诱导多能干细胞来源骨髓类器官模型再现了这一现象：CD68+单核/巨噬细胞散在分布，常位于血管附近，多数不被红细胞包围；而成红细胞独立形成簇状结构。定量显示巨噬细胞至最近成红细胞的平均距离约16 μm，与随机点相当，而成红细胞间距离接近零，证实人类骨髓中巨噬细胞与成红细胞无紧密关联。

小鼠和人类应激条件下的EBI

脾脏是小鼠关键髓外造血器官，尤其在应激条件下。空间转录组分析鉴定出红髓中C1q+巨噬细胞和红细胞簇，以及白髓中的淋巴样簇。脾脏中C1q+巨噬细胞-红细胞空间关联强于胎儿肝脏或骨髓，凸显脾脏EBI巨噬细胞的重要性。苯肼诱导的溶血性贫血导致显著脾肿大和髓外红细胞生成，Xenium研究显示C1q+巨噬细胞为中心的EBI扩增，红细胞数量显著增加，每个EBI平均红细胞数增至52.4±2.6个。尽管C1q+巨噬细胞为中心的EBI数量扩增，但其频率标准化后未改变；相反，巨噬细胞非依赖性红细胞相互作用标准化后显著增加，提示应激期间巨噬细胞非依赖性EBI功能增强。

在人类中，脾脏在应激红细胞生成中作用最小，骨髓足以满足增加的红细胞生成需求。研究人员分析了一例MDS贫血患者经低甲基化药物治疗后的骨髓血凝块空间转录组，发现与健康人相似，治疗后MDS骨髓显示C1Q+巨噬细胞与红细胞或祖细胞无显著空间关联，而红细胞-红细胞祖细胞空间邻近性强。Xenium分析和无偏倚相关研究证实了这一点。6例额外MDS病例（含3对治疗前后配对）的Visium分析揭示，治疗后红细胞-红细胞祖细胞空间相关性 consistently 高于治疗前，提示红细胞连接性降低是MDS的发育异常特征，可被治疗部分恢复。

ICAM4介导人类巨噬细胞非依赖性EBI形成

为识别人类巨噬细胞非依赖性EBI形成的受体-配体对，研究人员分析人类骨髓scRNA-seq数据，发现ICAM4-RHAG和ICAM4-ITGA2B为红细胞与红细胞祖细胞间的突出相互作用，而鼠类胎儿肝脏的等价分析则鉴定出Vcam1-Itga4等已知巨噬细胞-红细胞配对，与巨噬细胞为中心的EBI组织一致。

ICAM4在红细胞中高表达，在人类终末红细胞生成早期阶段（CD235a+CD71+）水平升高，随后晚期阶段（CD235a+CD71med）中度下降，提示ICAM4可能促进早期分化期间红细胞岛的形成和黏附，而后期下调可能促进成熟红细胞从微环境释放。iPS细胞来源骨髓类器官模型中，抗ICAM4抗体处理显著减少CD71+/CD235a+红细胞数量，不影响其分化，并显著减少巨噬细胞非依赖性EBI数量和大小。为排除巨噬细胞-红细胞相互作用的远程可能性，研究人员采用仅含促红细胞生成素（Epo）的甲基纤维素集落形成单位分析，该条件下人CD34+造血干祖细胞（HSPC）仅分化为红系谱系。结果一致显示抗ICAM4处理显著减少红系集落，而IgG、抗RHAG或抗αv-整合素处理无变化，支持ICAM4对人类巨噬细胞非依赖性EBI形成的关键作用。值得注意的是，MDS患者骨髓成红细胞中ICAM4水平较健康人显著降低，进一步提示ICAM4表达降低导致的巨噬细胞非依赖性EBI完整性受损可能是MDS的发育异常特征。

研究结论

该研究揭示了EBI解剖结构和分子机制的根本性物种差异。在小鼠中，经典巨噬细胞为中心的EBI持续存在于整个发育过程，C1q作为中央巨噬细胞的标志。C1q是经典补体途径的组分，通过与红细胞去核后嗜焦性红细胞核表面暴露的磷脂酰丝氨酸结合促进巨噬细胞吞噬。除吞噬作用外，C1q还调控巨噬细胞MerTK表达促进核清除，并限制凋亡细胞摄取期间炎症小体活性，两者对维持骨髓稳态至关重要。这些功能与已知小鼠EBI巨噬细胞作用一致，支持C1q作为巨噬细胞异质性的关键标志。

与鼠类相反，人类造血组织主要由巨噬细胞非依赖性红系细胞簇组成。尽管巨噬细胞为中心的EBI对小鼠红细胞生成至关重要，人类红细胞成熟表现出远为显著的空间自主性。经典巨噬细胞为中心的EBI在人类中确实存在，但罕见且随机。ICAM4对人类EBI完整性至关重要，该红细胞特异性糖蛋白最初鉴定为LW血型抗原，后被归类于细胞间黏附分子家族。该研究证实ICAM4对维持人类EBI完整性和红细胞增殖不可或缺，而物种特异性的细胞间黏附程序差异可能反映了上游主要红细胞调控因子如GATA1、KLF1或TAL1的转录调控差异。

值得注意的是，巨噬细胞非独立性红系细胞簇在小鼠造血组织中也普遍存在，空间转录组数据显示红细胞-红细胞空间相关指数超过红细胞与C1q+巨噬细胞之间的相关性，提示红系细胞聚集是红细胞生成微环境的保守特征。进化上，巨噬细胞为中心的EBI在人类中似乎已减弱，变得罕见且随机。这种结构差异可能部分反映细胞外基质差异：小鼠中纤维连接蛋白和层粘连蛋白支持红细胞黏附和终末分化，可能稳定巨噬细胞为中心的EBI；而人类骨髓以更大脂肪化和更低细胞密度为特征，可能施加不同空间约束，降低对巨噬细胞锚定的依赖。

虽然人类巨噬细胞未解剖整合入EBI，但它们可能以旁分泌方式执行类似功能，包括嗜焦性红细胞核吞噬和向红细胞供应营养。人类骨髓C1Q+巨噬细胞也可能在LW缺失个体中代偿EBI缺陷。两种物种中巨噬细胞非依赖性红系细胞簇的优势提出了关于嗜焦性红细胞核清除的重要问题，如其他吞噬细胞是否参与、是否存在巨噬细胞吞噬之外的替代清除机制等，该研究为解决这些问题提供了框架。</sup>