突变扫描揭示WNT降解复合体的底物辅助性自我调控机制

《Nature Genetics》：Mutational scanning reveals substrate-assisted autoregulation of the WNT destruction complex

　　

β-catenin降解复合体（BDC）调控WNT–β-catenin信号传导，并且是结直肠癌中的重要治疗靶点，但其生物化学复杂性阻碍了机制层面的理解。研究人员通过针对其组分CTNNB1、AXIN1、APC和GSK3B开展平铺式碱基编辑器筛选，绘制了BDC的序列–功能图谱。在约150个此前未报道、可影响WNT信号传导的突变中，研究发现了功能获得型（gain-of-function）和功能分离型（separation-of-function）等位变体，这些变体揭示了复合体组装机制，包括一个调控β-catenin与TCF/LEF转录因子结合的区域。关键的是，研究发现AXIN1–β-catenin界面控制着APC突变癌症中致癌性BDC的信号通量。在表达截短APC的细胞中，β-catenin本身充当BDC组装的支架，从而建立了一种底物辅助性自我调控机制。这种结构构型代表了一种尚未被开发利用的治疗脆弱性：增强AXIN1–β-catenin相互作用能够恢复降解复合体功能，并抑制结直肠癌细胞的生长。该突变资源为WNT通路的机制理解和治疗靶向奠定了基础。

该研究发表于《Nature Genetics》，聚焦WNT–β-catenin信号通路中β-catenin降解复合体（BDC）的组装与调控机制。WNT通路是维持组织发育和稳态的关键信号网络，而其持续异常激活则是多种肿瘤，尤其是结直肠癌（CRC）发生发展的核心驱动因素。尽管该通路临床意义重大，但目前尚缺乏获批的直接靶向药物，其中一个重要原因在于BDC由APC、AXIN1、CK1α、GSK3β和β-catenin等多种蛋白组成，内部存在多价、重叠且表面上具有冗余性的蛋白–蛋白相互作用（PPI），使其真实工作机制长期难以厘清。特别是在APC发生截短突变的肿瘤中，研究领域虽早已认识到APC是关键抑癌基因，但对于携带APC_mcr截短等位基因的“致癌性BDC”究竟如何维持中等强度、配体非依赖性的WNT信号，始终缺乏清晰解释。因此，开展能够在内源基因座水平系统解析BDC序列–功能关系的研究，既具有基础机制价值，也具有直接的治疗转化意义。

围绕这一问题，研究人员利用腺嘌呤碱基编辑器（ABE）和胞嘧啶碱基编辑器（CBE），在CTNNB1、AXIN1、APC与GSK3B四个内源基因的全部外显子范围内进行平铺式突变扫描，并结合荧光WNT转录报告系统，系统测定不同突变对信号强度的影响。研究不仅重现了大量已知功能位点，如β-catenin磷酸降解基序（phosphodegron）以及AXIN1与Tankyrase、Dishevelled（DVL）等互作界面，还发现了约150个此前未被报道的功能性突变。更重要的是，这些数据揭示出两类极具机制信息量的变体：一类是功能分离型突变，可在共享蛋白结合界面上选择性影响特定相互作用；另一类是功能获得型突变，可增强或削弱信号输出，从而标定关键调控热点。最终，研究提出：在APC截短背景下，β-catenin不仅是BDC的降解底物，还作为连接AXIN1与APC_mcr的核心支点，形成一种“底物辅助性自我调控”结构，决定致癌性BDC的装配效率与信号通量。增强AXIN1–β-catenin亲和力可以部分修复该受损复合体，并抑制APC突变型CRC细胞增殖，这一发现揭示了WNT通路新的治疗脆弱性。

本研究的关键技术方法主要包括：其一，在人源单倍体eHAP1细胞及HEK293T等细胞中建立7TS/7TG荧光WNT报告系统，并在携带内源基因的背景下实施NG-ABE8e与NG-BE3平铺式碱基编辑筛选；其二，利用荧光激活细胞分选（FACS）富集WNT高、低信号亚群，并结合Illumina测序与z-score分析建立突变功能图谱；其三，通过深度测序、共免疫沉淀（co-IP）、生物层干涉（BLI）、免疫荧光、RT-qPCR及体外重构拉下实验验证关键突变的分子机制；其四，在HAP1、RKO、SW480、DLD-1、LoVo和HT29等细胞模型中，比较野生型APC与APC_mcr背景下AXIN1亲和力调谐等位基因的功能差异。

Results

Tiled base editor screens targeting destruction complex genes
研究人员在APC、AXIN1、CTNNB1和GSK3B内源位点开展ABE/CBE平铺筛选，覆盖80%–90%的编码氨基酸残基，系统检测各突变对WNT报告活性的影响。筛选结果成功捕获多个经典功能区域，包括β-catenin N端磷酸降解基序以及AXIN1的Tankyrase、β-catenin和DVL结合位点。APC方面，只有位于首个SAMP重复之前的无义突变显著增强WNT信号，这与人类CRC中典型的APC突变簇区域（MCR）驱动模式高度一致。CTNNB1方面，多数命中位于磷酸降解基序内，符合其阻断β-catenin降解、持续激活信号的预期效应。总体而言，该部分结果证明筛选具有较高准确性，并可在内源环境中重现肿瘤遗传学规律。

The sequence–function landscape of β-catenin
研究将筛选命中映射至β-catenin结构，发现功能性错义突变集中于其与β-TrCP、BCL9、AXIN1、APC及TCF/LEF等结合界面。尤其在ARM重复5–10形成的site 4沟槽内，多个突变揭示了共享结合表面的精细功能分工。K435或R469等碱性残基突变削弱WNT和CHIR99021诱导信号，表明其对TCF/LEF结合至关重要；C466/A467突变则主要影响WNT诱导而非CHIR99021诱导反应，提示其调控模式更复杂。E462K则表现为功能获得型突变，可增强信号而不改变与TCF4的结合，说明该位点更可能选择性影响APC结合，是典型的功能分离型突变。该部分工作表明，结构上重叠的界面可通过单残基水平的扰动实现互作选择性分流。

Gain- and loss-of-function mutations in β-catenin
研究进一步分析β-catenin site 4至site 6中的若干新突变。L497P/L498P、E571K和I579T/L580P等突变降低Wnt-3a诱导的报告活性和内源AXIN2转录，但不影响β-catenin总量及其与AXIN1、APC、E-cadherin的结合，说明缺陷并非源于整体错误折叠，而是特异性损害其与TCF/LEF转录激活复合体的相互作用。BLI实验显示，E571K可显著降低β-catenin与TCF4的亲和力，同时不影响其与负调控因子ICAT的结合，进一步定义为功能分离型突变。另一方面，在ARM11–12区域，D624N/E626K/E629K和L621P等突变削弱信号并降低TCF/LEF结合，而C619Y/E620K及L643S/P;L644P则增强WNT敏感性。C619Y/E620K尤其通过破坏与ICAT的互作而间接增强与TCF4结合，提示ARM10–12是调节β-catenin转录输出的重要、此前认识不足的调控位点。

The sequence–function landscape of AXIN1
AXIN1作为负调控因子，其功能获得型突变表现为抑制WNT信号，功能缺失型突变则提高信号输出。筛选发现AXIN1功能获得型突变明显多于β-catenin，并富集于其C端区域，特别是DAX结构域。该结构域介导AXIN1在WNT刺激后募集至DVL所在受体复合体，因此其突变可抑制Wnt-3a诱导而不影响CHIR99021诱导，说明其作用位于受体近端。此外，Tankyrase结合界面的突变如R22Q可升高AXIN1稳定性并抑制信号；而RGS结构域与APC SAMP基序互作界面的突变则显著增强信号，符合该界面对BDC完整性的重要性。该部分结果建立了AXIN1多功能区域的系统序列–功能框架。

Mutations in AXIN1 can repair the oncogenic BDC
最关键的发现来自AXIN1 catenin-binding domain（CBD）。该区域突变同时出现增强和削弱信号的双向效应，表明其属于调控热点。V475A增强信号，而V475I抑制信号；体外BLI表明，V475I可提高AXIN1 CBD与β-catenin的结合亲和力，V475A则相反。研究进一步构建亲和力增强型AXIN1_AE（V475I/L479W）和亲和力降低型AXIN1_AR（L471A/D472A/H474A）。其中，AXIN1_AE与β-catenin亲和力较野生型提高约25倍，主要源于解离速率常数（k_off）显著下降；AXIN1_AR则几乎丧失可检测结合。该组工具性等位基因为后续在细胞内直接测试AXIN1–β-catenin亲和力对BDC组装和功能的影响提供了精准手段。

The AXIN1–β-catenin interaction is critical for the assembly of the oncogenic BDC
研究人员在同基因背景HAP1细胞中比较全长APC与APC 1337*背景下AXIN1_WT、AXIN1_AE和AXIN1_AR的效应。结果显示，在全长APC背景中，无论增强还是削弱AXIN1–β-catenin亲和力，对基础状态下BDC组装及AXIN2诱导影响都很小，说明β-catenin并非主要通过AXIN1直接进入野生型BDC。相反，在APC截短背景中，AXIN1_AE显著增强其与β-catenin及APC_mcr的结合，而AXIN1_AR几乎完全消除其与二者的关联，证明在失去AXIN1–APC直接RGS–SAMP连接后，β-catenin成为桥接AXIN1与APC_mcr的核心支点。体外重构实验进一步证实，保留15R重复但缺失SAMP重复的APC截短蛋白，只有在存在β-catenin时才能与AXIN1结合；若继续删除15R重复，则桥接作用消失。这表明致癌性BDC的存在依赖β-catenin介导的支架效应。

在功能层面，APC_mcr细胞对AXIN1–β-catenin亲和力改变高度敏感：AXIN1_AR进一步增加AXIN2 mRNA和核内β-catenin积累，而AXIN1_AE则产生相反效应。在SW480等携带APC截短突变的CRC细胞中，诱导表达AXIN1_AE可增加N端磷酸化β-catenin水平，说明受损BDC的降解功能得到部分恢复；同时，其抑制AXIN2表达、克隆形成和细胞增殖的能力均强于AXIN1_WT。相比之下，在携带全长APC的RKO细胞中，AXIN1_AE与AXIN1_WT无显著差异。这一结果表明，AXIN1–β-catenin相互作用是APC突变型致癌BDC中的速率限制步骤，也是潜在治疗切入点。

Discussion
讨论部分围绕野生型BDC与致癌性BDC的根本差异展开。研究提出，在全长APC存在时，APC与AXIN1可直接结合，APC的20R重复经GSK3β和CK1α磷酸化后获得对β-catenin极高的亲和力，因此β-catenin主要通过APC^p20R被募集进入BDC，而非首先结合AXIN1。此时，即使改变AXIN1–β-catenin亲和力，对基础复合体装配和信号输出影响也较小。WNT或CHIR99021抑制GSK3β后，APC 20R重复磷酸化下降、对β-catenin亲和力显著降低，β-catenin才更依赖与AXIN1的中等亲和力相互作用进入复合体。

而在APC_mcr背景下，APC失去SAMP重复，无法直接结合AXIN1，其剩余20R也难以被高效磷酸化，因此不再具备高亲和力β-catenin募集能力。在这种情况下，β-catenin同时结合AXIN1 CBD与APC的15R重复，充当复合体组装的“linchpin（关键支点）”。这意味着β-catenin既是BDC催化降解的底物，又是维持致癌性BDC装配所必需的组装因子。研究据此提出“底物辅助性自我调控”模型：β-catenin水平升高时，可促进致癌性BDC组装，从而提高自身磷酸化和降解速率；β-catenin水平下降时，BDC组装减少，降解速率随之降低，从而形成维持“恰到好处（just right）”信号通量的自调节回路。这一模型解释了为何CRC中常见的是部分功能保留的APC截短，而不是APC完全缺失。

研究结论部分可概括为：平铺式碱基编辑突变扫描系统揭示了β-catenin降解复合体的序列–功能图谱，发现了多类具有机制信息价值的功能获得型和功能分离型突变，并确定AXIN1–β-catenin界面是APC突变型致癌BDC信号通量的关键控制点。在表达截短APC的细胞中，β-catenin不仅是底物，而且作为支架促进BDC组装，形成底物辅助性自我调控机制。增强AXIN1–β-catenin相互作用能够恢复受损降解复合体功能并抑制结直肠癌细胞生长，提示该界面构成尚未被开发的治疗脆弱性。整体而言，本研究不仅深化了对WNT通路核心降解机器工作模式的理解，也为APC突变型结直肠癌的精准干预提供了新的分子基础。