双调蛋白（Amphiregulin, AREG）介导的EGFR活化驱动KRAS G12C突变非小细胞肺癌对KRAS G12C抑制剂的固有性和获得性耐药

《Oncogene》：Amphiregulin-mediated EGFR activation drives both intrinsic and acquired resistance to KRAS G12C inhibitors in KRAS G12C–mutant non-small cell lung cancer

　　

Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（KRAS）G12C抑制剂在KRAS G12C突变非小细胞肺癌（NSCLC）中已显示出临床疗效；然而，固有性和获得性耐药限制了其治疗潜力。因此，需要联合治疗策略来应对这些局限性。虽然多种联合方案目前正在临床试验中进行测试，但针对特定生物标志物的治疗方案仍有待深入探索。在本研究中，研究人员利用患者来源异种移植（PDX）模型和小鼠模型建立了固有性和获得性KRAS G12C抑制剂耐药肿瘤细胞。研究人员发现肿瘤细胞自分泌双调蛋白（AREG）介导的表皮生长因子受体（EGFR）磷酸化在固有性和获得性KRAS抑制剂耐药中均发挥关键作用。值得注意的是，在软脑膜癌病小鼠模型的中枢神经系统（CNS）转移性复发中观察到相同的耐药机制。RNAscope原位杂交（ISH）可在肿瘤组织中检测AREG mRNA，可能作为评估AREG表达的诊断工具。此外，将KRAS抑制剂与EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）联合使用可抑制肿瘤生长，有效克服耐药性。值得注意的是，在9例携带KRAS G12C突变的患者肿瘤样本中，有3例观察到高AREG mRNA表达，其中包括2例对sotorasib反应不佳的患者和1例达到部分缓解的患者。总之，AREG介导的EGFR活化是KRAS G12C突变NSCLC患者对KRAS抑制剂产生耐药的关键驱动因素。联合EGFR和KRAS抑制是克服治疗耐药的有前景的策略，可能增强并延长患者的临床获益。

肺癌是全球癌症相关死亡的首要原因，约占所有癌症死亡的21%。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，Kirsten鼠肉瘤病毒癌基因（KRAS）突变是最常见的致癌性改变之一，在西方人群的腺癌中发生率为20%-25%，在亚洲人群中为10%-15%。KRAS G12C突变是最频繁的KRAS突变之一，占所有KRAS突变NSCLC病例的39%。该突变导致KRAS蛋白固有GTP酶活性丧失，阻止GTP水解为GDP，从而使KRAS锁定在活性的GTP结合状态，持续驱动下游信号传导和细胞增殖。历史上，由于KRAS缺乏明确的药物结合口袋且核苷酸亲和力高，KRAS突变曾被认为是"不可成药"的。然而，2013年Ostrem等人证明共价小分子可选择性靶向KRAS G12C的Cys¹²，稳定其非活性的GDP结合形式，这一发现最终促成了临床批准的KRAS G12C抑制剂的开发。在KRAS G12C突变NSCLC患者中，KRAS抑制剂sotorasib和adagrasib在CodeBreaK-200和KRYSTAL-12试验中分别实现了28.1%和32%的客观缓解率（ORR）以及5.6个月和5.5个月的中位无进展生存期（PFS）。然而，这些疗效仍逊于EGFR突变和间变性淋巴瘤激酶（ALK）重排肿瘤等其他致癌基因驱动型NSCLC的靶向治疗。

固有性和获得性耐药均限制了KRAS G12C抑制剂反应的持久性，类似于EGFR和ALK酪氨酸激酶抑制剂（TKI）观察到的耐药现象。继发性KRAS突变是常见的耐药机制，包括G12D/R/V/W、G13D、Q61H、R68S、H95D/Q/R和Y96C/D等，这些突变直接破坏药物结合并赋予KRAS抑制剂耐药性。此外，通过NRAS、BRAF、EGFR和FGFR2等基因改变以及MET和MYC扩增实现的旁路信号传导，使肿瘤细胞能够重新激活MAPK或PI3K-AKT信号传导，从而降低抑制剂疗效。EGFR还被牵涉到KRAS抑制后MAPK和PI3K通路的反馈激活，尽管其尚未被验证为指导治疗的预测性生物标志物。此外，KRAS G12C抑制剂在合并中枢神经系统（CNS）转移的患者中疗效欠佳，而CNS特异性耐药的分子决定因素在很大程度上仍不明确。本研究旨在鉴定能够支持开发有效联合策略以对抗KRAS G12C抑制剂耐药的临床相关生物标志物，利用来源于KRAS G12C突变NSCLC小鼠模型和患者来源异种移植（PDX）模型的耐药肿瘤细胞，研究人员探究了全身性和CNS耐药的机制，以指导生物标志物驱动的治疗方法。

本研究主要采用的关键技术方法包括：建立患者来源异种移植（PDX）模型和皮下肿瘤异种移植小鼠模型（SHO-SCID免疫缺陷小鼠）以模拟固有性和获得性耐药；利用RNAscope原位杂交技术对福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织切片进行AREG mRNA的空间定位检测；通过酶联免疫吸附测定（ELISA）定量检测细胞培养上清液中EGFR配体（AREG、TGF-α、EGF）的分泌水平；运用小干扰RNA（siRNA）介导的基因敲降技术功能验证AREG和EGFR在耐药中的作用；采用蛋白质免疫印迹（Western blot）分析受体酪氨酸激酶及其下游信号通路的磷酸化状态；通过MTT比色法进行细胞活力测定以评估药物敏感性；利用免疫组织化学（IHC）和H评分半定量分析组织样本中p-EGFR蛋白表达；对临床队列样本（来源于金泽大学医院、JA富山市高冈医院、富山县立中央医院的KRAS G12C突变NSCLC患者治疗前肿瘤标本）进行回顾性分析。

研究结果部分：

一、AREG介导的EGFR磷酸化导致KRAS G12C突变NSCLC细胞系对KRAS G12C抑制剂的固有性耐药（IR）。研究人员评估了8种KRAS G12C突变NSCLC细胞系对sotorasib和adagrasib的反应性，发现NCI-H358和LU65细胞高度敏感，而H2030、H2122、H23、Calu-1、SW1573和KU-001细胞表现出不同程度的敏感性降低，提示存在固有性耐药。通过siRNA介导的KRAS敲降实验，研究人员发现敏感细胞系表现出KRAS依赖性，而固有性耐药细胞系中KRAS沉默对增殖影响甚微，提示存在替代信号通路。蛋白质免疫印迹分析显示，H358、H2122和KU-001细胞中EGFR磷酸化水平升高。ELISA检测发现这三种高p-EGFR细胞系的培养上清液中AREG上调，而TGF-α和EGF minimally detected。CCLE数据库的RNA测序分析也支持AREG在高p-EGFR细胞中的高表达。RNAscope原位杂交在H358、H2122异种移植瘤及KU-001 PDX肿瘤中检测到高AREG mRNA表达。功能验证实验表明，siRNA敲降AREG或EGFR均可显著降低H2122和KU-001细胞在sotorasib存在条件下的活力，并抑制EGFR磷酸化。

二、AREG-EGFR通路活化与KRAS G12C突变NSCLC患者对sotorasib的耐药相关。研究人员分析了9例接受sotorasib单药治疗的KRAS G12C突变NSCLC患者肿瘤组织（8例FFPE组织及1例KU-001恶性腹水细胞块）。免疫组织化学显示8/9例组织p-EGFR阳性，唯一p-EGFR阴性患者获得完全缓解，PFS达468天；而p-EGFR阳性病例疗效较差。RNAscope分析发现3例p-EGFR阳性肿瘤（患者4号、7号及KU-001腹水细胞块）存在高AREG mRNA表达。其中7号患者仅达疾病稳定，PFS仅62天，提示反应不佳。KU-001患者经claudin-1免疫荧光联合RNAscope证实肿瘤细胞特异性AREG mRNA增高。4号患者虽基线AREG和p-EGFR升高，但仍获得部分缓解（肿瘤缩小37%），该发现与H358细胞系结果一致，提示早期靶向AREG-EGFR轴可能增强治疗反应。

三、EGFR TKI联合使用增强NSCLC对KRAS G12C抑制剂的敏感性。体外实验中，在sotorasib敏感细胞系LU65中，联合EGFR TKI未改善反应；而AREG-EGFR阳性的H358细胞对sotorasib敏感性增强，IC₅₀显著降低。在耐药细胞H2122和KU-001中，osimertinib和erlotinib均增敏sotorasib。蛋白质免疫印迹显示联合治疗有效抑制EGFR磷酸化及下游ERK和AKT信号，并增加cleaved caspase-3表达提示凋亡增强。体内实验中，H358异种移植瘤联合治疗显著抑制肿瘤生长，停药后45天内无肿瘤再生；H2122异种移植瘤中联合治疗较单药更有效；KU-001 PDX模型中联合治疗接近完全根除肿瘤。

四、LU65细胞在体获得KRAS抑制剂耐药性。通过长期sotorasib或adagrasib治疗SHO-SCID小鼠皮下LU65肿瘤，获得获得性耐药细胞系LU65 SC-sotAR和LU65 SC-adaAR。这些细胞对两种KRAS抑制剂交叉耐药。蛋白质免疫印迹显示耐药细胞中EGFR磷酸化增强，全外显子测序排除已知继发性KRAS突变和EGFR突变/扩增。ELISA显示耐药细胞中AREG蛋白表达显著增加，RNA测序确认AREG和EGFR转录本上调。RNAscope原位杂交在耐药肿瘤中检测到 elevated AREG mRNA。siRNA敲降AREG或EGFR可恢复sotorasib或adagrasib敏感性，而外源性重组AREG可增强亲代LU65细胞对KRAS抑制剂的耐药性。

五、LU65细胞在软脑膜癌病（LMC）小鼠模型中通过AREG介导的EGFR活化获得sotorasib耐药性。通过向SHO-SCID小鼠软脑膜腔注射荧光素酶标记的LU65细胞并长期sotorasib治疗，获得LMC获得性耐药细胞LU65 LMC-sotAR。这些细胞表现出中等程度sotorasib耐药，蛋白质免疫印迹和ELISA显示AREG表达增加和EGFR磷酸化增强，提示CNS转移中亦存在相同耐药机制。

六、EGFR TKI联合使用使获得性耐药的LU65细胞重新致敏。体外实验中，osimertinib或erlotinib联合sotorasib以剂量依赖性方式抑制LU65 SC-sotAR细胞活力，osimertinib联合adagrasib对LU65 SC-adaAR有类似效果，osimertinib亦恢复LU65 LMC-sotAR细胞对sotorasib的敏感性。蛋白质免疫印迹显示联合治疗显著抑制EGFR、ERK和AKT磷酸化。体内实验中，sotorasib单药未能抑制LU65 SC-sotAR异种移植瘤生长，而联合osimertinib或erlotinib显著抑制肿瘤生长。免疫组织化学分析证实联合治疗较单药更有效降低p-EGFR H评分。

讨论与结论：本研究证明AREG介导的EGFR磷酸化是KRAS G12C突变NSCLC（包括CNS转移）对KRAS G12C抑制剂固有性和获得性耐药的主要驱动因素。RNAscope原位杂交可在FFPE标本中实现AREG mRNA的空间定位检测，支持其作为识别可能从联合KRAS G12C和EGFR抑制中获益患者的伴随诊断工具的潜力。

与EGFR突变或扩增驱动的耐药不同，AREG介导的EGFR活化是非遗传性的，反映了治疗诱导的信号重编程，可能更易于早期干预。AREG刺激不仅诱导EGFR磷酸化，还上调EGFR表达，可能通过增强膜积累和受体回收实现。CNS转移的耐药机制常与颅外病变不同，但研究人员在两个部位均观察到AREG介导的EGFR活化，这可能是因为KRAS抑制剂缺乏强效颅内疗效所致。非突变性EGFR活化的检测在临床实践中仍具挑战：PCR-based方法缺乏空间分辨率，空间转录组学目前对常规应用而言成本过高；免疫组织化学对AREG检测常不可靠，因其成熟蛋白被分泌且组织中保留较差。RNAscope原位杂交通过实现FFPE组织中低丰度mRNA的敏感特异性检测同时保留形态学背景，解决了这些局限性。

功能上，将KRAS G12C抑制剂与EGFR TKI（如osimertinib或erlotinib）联合可有效抑制AREG介导的EGFR活化，在固有性和获得性耐药模型中恢复药物敏感性。尽管低至中等浓度osimertinib被认为可保留野生型EGFR，但0.3 μM或更高浓度在KRAS抑制剂存在下可抑制耐药细胞活力。临床前药代动力学研究显示osimertinib在脑和肿瘤组织中分布良好，提示其可控制KRAS抑制剂的中枢神经系统耐药。体内研究中，联合治疗在两种固有性耐药异种移植模型（包括1个PDX模型）和1个获得性耐药模型中均导致显著肿瘤消退，而任一单药无效。即使在sotorasib敏感模型中，联合治疗也较单药获得更优的肿瘤反应，并在停药后维持更长时间的生长抑制。

研究结论部分原文总结：KRAS G12C突变肺癌细胞通过AREG介导的EGFR活化（包括CNS转移）对KRAS抑制剂产生固有性和获得性耐药。RNAscope原位杂交可在FFPE标本中进行AREG mRNA的空间定位检测，提供有前景的临床诊断方法。此外，将KRAS G12C抑制剂与EGFR TKI（如osimer-tinib）联合可在临床前模型中克服这种耐药性。这些发现为生物标志物指导的临床试验提供了强有力的理论依据，以研究KRAS G12C突变NSCLC中KRAS和EGFR双重抑制的疗效。