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数十年来，人们一直认为传统中药中的生物活性成分主要是诸如生物碱、酮类、甾体及萜类等化学小分子。1,2,3 相比之下，由于长期认为核酸在煎煮过程中不稳定且无法通过胃肠道消化，因此很少受到关注。然而最近的研究打破了这一观念，表明某些源自中药的miRNA能够经受住传统煎煮过程，以完整形式被吸收并保持其治疗活性。4,5 尽管有了这些进展，RNA成分仍未被纳入对中药质量、加工方法或临床应用的评估体系中。因此，新兴的分子证据与当前的制药实践之间仍存在巨大差距。在本研究中，我们以金银花中的MIR2911为研究对象，探讨不同来源、加工方式和提取方法如何影响药用RNA的完整性、稳定性、生物利用度以及抗病毒效果。

为能够准确测定不同生物样本中的MIR2911含量，我们首先建立了一种经过回收率校正的测量体系。在样品裂解过程中，向其中加入不同浓度的合成miRNA标准品，以此判断提取过程中的损失情况。植物煎剂和组织中的回收率大致在2%左右，而血清中的回收率略高，约为4%（见图1a）。这一方法使得我们能够在复杂的生物样本中精确测定MIR2911的含量。

图1
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金银花miRNA MIR2911的加工依赖性完整性及生物活性。a将合成MIR2911加入不同样本后检测其回收率（n?=?4；蔬菜汤、肝脏和血清）。b检测新鲜金银花不同部位（花蕾、盛开花朵、茎和叶）中的MIR2911含量（n?=?4；左侧面板）。还检测了来自不同地区（河南省、山东省和河北省）以及不同干燥方法（烘干和风干）的干燥金银花花蕾中的MIR2911含量（n?=?8；右侧面板）。c检测处理过的高浓度金银花提取物在乙醇处理前后的MIR2911含量（n?=?4；左上侧面板）。还检测了高浓度金银花提取物及多种中药制剂（银黄颗粒、连花清瘟胶囊、复合金银花颗粒和双黄连口服液）中的MIR2911含量（n?=?4；右上侧面板）。通过BHK细胞斑块实验，检测转染合成MIR2911、银黄颗粒RNA或高浓度金银花提取物RNA后的HEK293T细胞上清液中的病毒滴度（n?=?4；左下侧面板）。通过定量RT-PCR检测转染后的JEV p3病毒感染细胞中的JEV NS5 mRNA含量（n?=?4；右下侧面板）。d检测SH-SY5Y细胞中的IFN-β含量，以及BV2细胞中的IL-1β和IL-6含量。这些细胞分别被活的JEV p3病毒株或经紫外线灭活的JEV p3病毒株感染，之后再转染MIR2911（n?=?4）。数据以均值±标准误表示。统计分析采用单因素方差分析或双侧t检验。***P?<?0.001；****P?<?0.0001；ns表示无显著差异

接下来，我们研究了植物特性及采收后的加工处理对MIR2911含量的影响。在各种植物组织中，未开放的花蕾所含的MIR2911含量最高，远高于盛开的花朵、茎和叶（见图1b）。来自不同地区的金银花样本中MIR2911含量差异显著，其中河南省封丘县的样本含量最高（见图1b）。干燥方式也会对含量产生影响：烘干的样本所含的MIR2911含量是风干样本的3.2倍左右（见图1b）。这些结果表明，植物部位、地理来源以及干燥方式都是决定MIR2911含量的重要因素。

目前中药的现代制药工艺中常常使用乙醇提取来富集化学成分。为了评估酒精处理对miRNA活性成分的影响，我们模拟符合药典要求的加工流程，用60%的乙醇溶液从金银花煎剂中沉淀出非乙醇成分。这种处理方式导致MIR2911含量大幅下降，相较于水煎剂，其含量减少了93.6?±?0.5%（见图1c）。市面上的中药制剂中也几乎不含MIR2911（见图1c）。我们之前的研究已经表明，MIR2911可以通过与病毒RNA直接相互作用，有效抑制日本脑炎病毒p3的复制，表现为病毒颗粒生成量及JEV p3 mRNA含量的降低。而从经过乙醇处理的中药制剂中分离出的RNA则几乎不具备抑制JEV p3复制的活性，这说明酒精提取会严重破坏传统煎剂中的抗病毒RNA活性（见图1c）。因此，乙醇提取会消除具有抗病毒功能的miRNA成分，进而降低中药的療效。

我们的分析表明，MIR2911可以直接靶向JEV p3基因组中的多个区域。为了评估其在人体内的抗病毒活性，我们在健康志愿者口服金银花煎剂后，从其血清中分离出外泌体，并将其与JEV感染的细胞共培养。来自经过金银花煎剂处理的志愿者的外泌体能有效抑制JEV的复制。为区分两种可能的作用机制——直接免疫调节与通过抑制病毒复制实现间接抑制——我们使用了经紫外线灭活的JEV p3病毒株，这类病毒虽仍能识别模式识别受体，但无法引发有效感染。在感染活的JEV病毒的SH-SY5Y细胞中，MIR2911显著降低了IFN-β的分泌水平；在BV2小胶质细胞中，它也降低了IL-1β和IL-6的释放水平。而当细胞被紫外线灭活的JEV病毒株感染时，MIR2911对这些细胞因子的分泌没有明显影响（见图1d）。这些数据表明，促炎细胞因子的减少是病毒复制被抑制的结果，而非MIR2911直接发挥免疫调节作用的表现。

目前中国药典中对中药的标准主要侧重于保留化学成分，并未考虑基于核酸的生物活性，这可能是某些加工制剂疗效不佳的原因之一。以金银花中的MIR2911作为概念验证案例，我们证明了传统的水煎法能够保留具有抗病毒活性的RNA成分，而如今常用的乙醇提取法则会导致这些RNA完全丢失，从而说明了加工条件会如何显著影响基于RNA的治疗成分的丰度、稳定性及其功能。由于不同草药中也存在MIR2911，因此它可能无法作为独立的鉴定标志物。我们的研究结果表明，通过对不同草药煎剂进行系统分析并建立相应的参考数据库，miRNA分析可作为一种更广泛的中药质量控制手段。

这些研究结果还对关于膳食及植物来源微RNA吸收的争论具有启示意义。最初有关植物微RNA能跨界调控的报道因技术限制及缺乏机制证据而引发争议。然而，近年来的研究逐渐提供了更多证据，表明某些植物微RNA能够经受住煎煮过程，通过口腔途径被吸收，进入哺乳动物体内循环，并在目标组织中调节基因表达。此外，也有研究揭示了这些微RNA的吸收和稳定机制。通过结合加工分析、人体血清外泌体递送实验以及AGO2介导的抗病毒机制研究，本项研究进一步支持了这样一种观点：在特定的生物学和制药条件下，药用RNA确实具有实际应用价值。

综上所述，这些研究结果表明，基于RNA的生物活性是某些中药制剂中一种具有生物学合理性且易于通过实验研究的成分。我们的研究确定MIR2911是一种对加工条件敏感的小RNA，它能通过典型的miRNA干扰机制发挥抗病毒作用。同时我们认为，具有功能意义的小RNA或许可以补充现有的中药制备及生物活性评估方法。建立能够体现RNA生物活性的评估标准，对于推动中药的现代化、标准化以及科学化评价具有重要意义。