低亲和力抗体部分下调血小板糖蛋白VI提供持久且安全的抗血栓保护

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Partial downregulation of platelet glycoprotein VI by low affinity antibodies confers sustained and safe antithrombotic protection

　　

血小板糖蛋白（GP）VI是血小板特异性激活受体，可结合胶原蛋白和纤维蛋白（原），是抗血栓治疗的有前景靶点。针对GPVI的抑制性Fab片段在小鼠动脉血栓形成和缺血性卒中模型中可提供强效保护，且在小鼠或人中不损害止血功能。然而，其体内半衰期较短，限制了长期治疗的适用性。相比之下，靶向GPVI的IgG（如JAQ1-3）可诱导小鼠完全受体耗竭并产生GPVI敲除样（GPVIKO-like）表型，该机制在具有抗GPVI自身抗体的人中同样可见。虽然GPVI缺陷仅导致中度止血缺陷，但与高剂量阿司匹林（100 mg/kg）联用时出血风险增加。利用人源化GPVI（hGP6^tg/tg）小鼠模型，研究人员证明高亲和力抗人GPVI IgG（Emf1 K_D 0.490 nM，Emf2）可诱导GPVIKO-like表型并具有抗血栓疗效。相比之下，低亲和力结合hGPVI的JAQ1 IgG（K_D：9.6 nM）仅诱导约50%的GPVI下调，产生可持续长达10天的稳定低密度GPVI（GPVI^LO）表型。GPVI^LO血小板显示聚集受损、促凝活性消除，且与Fab介导的抑制类似，可在不增加出血的情况下提供动脉血栓形成和脂多糖（LPS）诱导的血栓炎症保护，即使与高剂量阿司匹林联用亦然。低亲和力抗小鼠GPVI抗体JAQ4（K_D = 21 nM）在野生型小鼠中诱导了可比较的GPVI^LO表型。NOD/SCID小鼠中人血小板输注显示，完全和部分GPVI耗竭分别也可在人血小板体内发生。这些发现确立了部分、亲和力依赖性GPVI下调可提供持续抗血栓保护同时保留止血功能，为长期血小板抑制提供有前景的策略。

血小板活化与聚集是正常止血所必需的生理过程，但也是心肌梗死（MI）和急性缺血性卒中（AIS）等危及生命缺血性疾病的主要病理机制，这些疾病仍是全球死亡和严重残疾的首要原因。现有抗血小板药物虽不可或缺，但均存在固有出血风险，尤其需要双重抗血小板治疗或联合抗凝治疗时。因此，开发在不降低疗效的前提下减少出血风险的新型抗血栓治疗方案具有重大临床需求。

GPVI作为血小板特异性受体，其缺失或功能抑制在动脉血栓形成和血栓炎症病理模型中显示出强效保护作用而不引起严重出血并发症，使其成为极具前景的药理学靶点。GPVI是一种约65 kDa的血小板和巨核细胞特异性胶原蛋白/纤维蛋白（原）受体，在质膜中与含有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）的Fc受体γ亚基（FcRγ-chain）非共价结合。受体在多变价配体上聚集后诱导信号传导，导致包括形态改变、整合素功能上调、颗粒释放和促凝磷脂酰丝氨酸（PS）表面暴露在内的强效血小板活化。GPVI信号强度高度依赖于受体在血小板膜中的密度，高GPVI表面表达水平与血栓形成、卒中和急性冠状动脉综合征风险增加相关。

早期开发的基于抗体的GPVI抑制剂主要包括人源化抗体Fab片段EMA601和ACT017（Glenzocimab），两者均通过干扰GPVI信号传导而非配体结合来发挥抑制作用，在实验动物和初步临床研究中显示安全性良好。然而，由于肾脏快速清除，Fab片段体内半衰期较短，适用于急性病症治疗但不适合长期GPVI抑制。IgG类抗GPVI抗体（如JAQ1、2、3）则可通过Fc依赖性机制诱导GPVI免疫耗竭，产生持续长达两周的GPVIKO-like表型。类似机制也见于产生抗GPVI自身抗体的患者。尽管GPVI单纯缺陷仅引起中度出血，但与高剂量阿司匹林（100 mg/kg）联用时出血时间显著延长，存在潜在安全隐患。

基于此背景，研究人员探究低亲和力抗GPVI抗体是否能在实现持续疗效的同时，避免完全GPVI耗竭带来的出血风险，为长期抗血小板治疗提供更安全选择。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究者使用人源化GPVI转基因（hGP6^tg/tg）小鼠模型、NOD/SCID人源化小鼠模型、生物膜层干涉技术（BLI）测定抗体亲和力、流式细胞术检测GPVI表面表达、全血灌流实验评估血小板黏附和聚集功能、机械性主动脉损伤模型评价体内抗血栓效果、LPS吸入诱导的急性肺损伤（ALI）模型评估血栓炎症保护效果，以及尾出血实验评估止血功能。

**Emf1诱导hGP6^tg/tg小鼠完全hGPVI免疫耗竭**

研究人员首先验证hGPVI是否可在体内被完全下调。采用4 mg/kg静脉注射的Emf1处理hGP6^tg/tg小鼠，观察到短暂的血小板计数下降后迅速恢复。流式细胞术检测显示，Emf1处理后30分钟即出现hGPVI从质膜完全消失，持续至第12天，随后逐渐恢复并于第23天完全复原。Western blot分析证实第5天hGPVI几乎完全缺失，流式细胞术显示形成GPVIKO-like表型。剂量反应实验表明，即使低至0.1 mg/kg的Emf1也能诱导完全hGPVI耗竭，但较低剂量时GPVI缺失持续时间缩短，显示抗体剂量与GPVI缺陷持续时间直接相关。其F(ab)2片段既不引起血小板减少也不导致受体耗竭，证实该过程为Fc依赖性机制。Emf1对野生型小鼠无作用，证实其人GPVI特异性。

**JAQ1低亲和力结合hGPVI并在体内诱导部分hGPVI耗竭**

研究人员发现，JAQ1 IgG在野生型小鼠中完全耗竭mGPVI，但在hGP6^tg/tg小鼠中仅引起部分hGPVI下调（降至约47.4%），形成稳定的低密度hGPVI（hGPVI^LO）表型。流式细胞术显示产生均一的血小板群体而非两个亚群。值得注意的是，将JAQ1剂量增至8或16 mg/kg并未进一步降低hGPVI水平，提示存在可饱和的GPVI下调阈值。生物膜层干涉技术测定显示JAQ1对mGPVI的K_D为0.435 nM，而对hGPVI的K_D为9.60 nM，亲和力差异显著。Emf1对hGPVI的亲和力（K_D 0.490 nM）与JAQ1对mGPVI相当。为验证亲和力假说，研究人员使用低亲和力抗mGPVI抗体JAQ4（K_D：21 nM）处理野生型小鼠，结果诱导了可比的mGPVI^LO表型（降至约46.3%），证实低亲和力抗体普遍具有诱导部分受体免疫耗竭的潜力。

**hGPVI^LO血小板对GPVI特异性激动剂的反应显著降低**

通过流式细胞术和功能实验评估，hGPVI^LO血小板对所有测试浓度的胶原相关肽（CRP）几乎无反应，对更强效的GPVI激动剂convulxin（CVX）反应显著受损，但凝血酶诱导的活化不受影响。标准光透射聚集实验中，hGPVI^LO血小板对CRP和CVX的聚集反应显著降低，高浓度胶原（10和5 μg/mL）时聚集显著减少，低浓度胶原（2.5 μg/mL）时完全消除。全血灌流实验中，hGPVI^LO血小板在动脉剪切速率（1000 s^-1）下对胶原的聚集形成受损。即使JAQ1剂量增加至8或16 mg/kg，血小板活化谱与4 mg/kg组相似，无进一步功能抑制。

**部分hGPVI耗竭独立于受体密度**

为排除受体密度对耗竭程度的影响，研究人员检测了仅表达50% hGPVI和50% mGPVI的杂合子（hGP6^wt/tg）小鼠。JAQ1处理导致mGPVI完全耗竭而hGPVI仅降低52.7%，再次证明部分耗竭效应与受体密度无关。Emf1和Emf2处理则特异性耗竭hGPVI而不影响mGPVI，进一步证实仅直接靶向的受体会被下调。

**抗体亲和力决定体内受体下调程度**

通过体外ITAM信号传导分析，研究人员发现Emf1和JAQ1均可诱导可检测的ITAM磷酸化（Syk、LAT和PLCγ2），但JAQ1的信号强度始终弱于Emf1。该模式在人血小板和hGP6^tg/tg血小板中保守，表明信号依赖性GPVI下调机制跨物种保守。低剂量肾上腺素（10 μM）和ADP（5 μM）可协同增强两种抗体的血小板聚集效应，但Emf1的作用明显强于JAQ1，再次反映信号强度差异。2.4G2抗体阻断FcγRIIa/b后，Emf1、Emf2和JAQ1均不能引起血小板减少或GPVI耗竭，证实FcγR依赖性机制。NOD/SCID小鼠人血小板输注实验直接证明，Emf1和JAQ1分别在人血小板体内诱导约100%和约48%的hGPVI耗竭，与hGP6^tg/tg模型结果一致。反复注射实验显示，第二和第三次注射JAQ1或Emf1均不再引起血小板减少或进一步受体降低，但可维持GPVI^LO和GPVIKO-like表型，分别长达25天和41天。

**hGPVI^LO小鼠具有强效抗血栓保护、减轻LPS诱导ALI但止血功能完整**

主动脉机械损伤模型中，对照IgG组100%（12/12）形成稳定血管闭塞，Emf1处理组（hGPVIKO-like）约85.7%（12/14）未形成稳定血栓，JAQ1处理组（hGPVILO）约64.3%（9/14）受到保护。老年小鼠（约27周）中保护效果同样明显。hGPVIKO-like动物仅显示短暂血流减少，而hGPVILO小鼠形成短暂完全闭塞后快速再通，提示血栓稳定性降低。

LPS诱导急性肺损伤模型中，所有治疗%的GPVI抑制处理均减少体温下降，hGPVILO和Emf1Fab处理显著降低支气管肺泡灌洗液（BALF）血红蛋白含量。免疫荧光显微镜显示肺中性和血小板浸润显著减少，中性粒细胞外渗至肺泡空间也显著降低。流式基血小板黏附分析显示，hGPVILO血小板对胶原黏附未受损，但血栓形成受损，PS暴露标志的促凝活性在整个观察期间几乎完全消除。钙离子灌注后，对照组PS暴露显著增加而hGPVILO组无此现象，且hGPVILO样本出现明显血栓解体。更高剪切速率（1700 s^-1）下结果一致。

尾出血实验中，hGPVIKO-like小鼠出血时间轻度但显著延长，而hGPVILO小鼠出血时间与对照无差异。与高剂量阿司匹林（100 mg/kg）联用时，hGPVIKO-like小鼠出现严重止血缺陷，72.7%（8/11）无法在20分钟观察期内止血；而hGPVILO小鼠仅轻度延长出血时间，所有动物均可止血。类似效应也见于Emf1Fab联合高剂量阿司匹林组，提示GPVI黏附功能对止血有重要贡献。

**讨论部分总结**

研究人员首次证明药理学下调血小板表面GPVI是可行的，低亲和力抗体可诱导稳定的GPVI^LO表型。这种部分耗竭足以提供强效抗血栓和抗血栓炎症保护而不增加出血风险，与完全GPVI耗竭或遗传学GPVI缺陷形成对比。

GPVI作为治疗靶点的吸引力在于其仅在巨核细胞和血小板表达，脱靶效应最小。人遗传性GPVI缺陷通常仅伴轻度出血症状，凸显其在正常止血中的非必需性。GPVI是首个被证明可通过抗体介导机制在体内耗竭的血小板受体，为抗血小板治疗引入了新概念。由于血小板无核且蛋白质合成极少，特别适合不可逆抑制，这与阿司匹林不可逆抑制COX、氯吡格雷不可逆抑制P2Y₁₂的长期效应原理一致。在血小板黏附受体中，仅GPVI和CLEC-2含有（血）ITAM基序且对抗体诱导的不可逆沉默敏感。但CLEC-2抑制存在安全性顾虑，因其在维持血液-淋巴分离中的关键作用及其靶向与脑静脉窦血栓等不良事件相关。

正常止血中的多重冗余激活途径（凝血酶、ADP、TxA₂等）足以在GPVI功能缺失时触发血栓形成，这解释了GPVI缺陷人和小鼠的轻度出血表型，以及仅当额外途径被抑制时出血风险才显著增加的现象。单价的Fab片段虽前景良好但半衰期短限制长期应用；IgG介导的免疫耗竭则提供更持久的方案。临床观察支持类似机制可在人中长期下调GPVI。

受体耗竭机制涉及Fcγ受体IIB依赖性血小板在肝脏的募集，IgG调理的GPVI在肝窦内皮细胞（LSECs）上聚集导致耗竭。该过程依赖GPVI信号传导，因为表达信号缺陷FcRγ-chain变体的小鼠无法经历IgG介导的受体耗竭。研究揭示高亲和力结合对完全耗竭至关重要，而低亲和力抗体可重复诱导仅部分下调（~50%），提示完全免疫耗竭需要达到信号阈值。推测低亲和力抗体无法诱导足够的受体聚集和下游信号来有效激活FcRγ-ITAM信号通路。

人血小板表达而鼠血小板不表达FcγRIIA（CD32）引发潜在顾虑，但研究数据表明其不发挥功能性作用：Western blot分析显示抗GPVI抗体结合后人血小板和小鼠血小板的细胞内信号相似，提示FcγRIIA未被激活。NOD/SCID人源化小鼠中人血小板输注进一步证实完全和部分受体下调均可在人血小板体内实现。2.4G2阻断FcγRIIB后阻止血小板减少和受体丢失，支持FcγRIIB表达LSECs在该过程中的确立作用。

来自GPVI自身抗体患者的数据进一步支持该机制的临床相关性。与这种非受控免疫反应不同，研究人员证明初始短暂血小板扣押和GPVI耗竭血小板返回循环后，反复给予Emf1或JAQ1不再引起新的血小板减少，同时维持稳定受体下调，证明了GPVI靶向持续治疗在动脉血栓和血栓炎症预防中的可行性。

hGPVI^LO表型揭示了血小板胶原黏附与GPVI依赖性信号和PS暴露的机械性解偶联，从而以最小时实现有效抗血栓保护。这支持此前GPVI阻断选择性损害信号传导而保留黏附的发现，提示残余GPVI介导黏附足以维持血管完整性和止血功能，而细胞内GPVI信号是动脉血栓和血栓炎症的关键驱动因素。

在LPS诱导的肺血栓炎症和炎症性出血模型中，hGPVIKO-like小鼠显示中性粒细胞募集和外渗显著减少，但血管渗漏未改善（BALF血红蛋白含量与LPS处理对照无差异）。相比之下，hGPVI^LO和Emf1Fab处理均显著降低BALF血红蛋白含量，提示炎症应激下血管屏障功能改善。LPS吸入模拟急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的关键特征，完全GPVI抑制或部分GPVI耗竭可能限制水肿形成和出血。

GPVI在限制炎症和恶性肿瘤相关凝血病中的失血方面发挥关键作用。此类情况下，部分GPVI下调可能优于完全受体耗竭，因其可降低血栓风险同时保留必要止血功能。GPVI表面表达水平已知受精密调控，支持最优血小板功能需要临界受体密度的概念。

现有抗血小板长期治疗策略包括单药治疗（SAPT，阿司匹林）和双联抗血小板治疗（DAPT，阿司匹林联合P2Y12抑制剂如氯吡格雷或替格瑞洛），后者增强保护但长期出血风险增加。靶向膜糖蛋白如GPVI以调节其表面丰度可能提供平衡抗血栓疗效与改善安全性的新型治疗策略。

IgG抗体体内半衰期长，可减少给药频率实现持续抗血栓效果。研究中反复给予Emf1或JAQ1分别延长GPVI下调至41天和25天，因循环中已GPVI耗竭的血小板群体对抗体诱导的扣押或清除不敏感。新产生的表达完整GPVI的血小板持续进入循环，但仅占血小板池的很小部分，仅短暂扣押后返回循环。该方法的主要局限在于初始剂量后的短暂血小板减少，可能通过渐进给药策略或缓释制剂缓解，对既有血小板减少或出血风险升高的患者尤为重要。

**研究结论**

研究人员特此证明抗体介导的hGPVI下调是可行且可扩展的体内受体沉默方法。高亲和力抗体诱导完全GPVI耗竭，而低亲和力变体产生稳定的GPVI^LO表型，其特征为减少血栓形成但保留胶原黏附。这种中间表型可能为完全GPVI抑制提供更安全的替代方案，尤其适用于包括与阿司匹林联合方案的长期抗血栓治疗。