生理性剪切流增强人血小板的胞饮作用

《Scientific Reports》：Physiological shear flow enhances pinocytosis in human platelets

　　

胞饮作用，即细胞对细胞外液体的摄取，是血小板一项重要但尚未被充分阐明的功能。尽管血小板在循环中持续暴露于剪切流（shear flow），剪切如何调节人血小板胞饮作用的机制仍不明确。研究人员在本研究中采用旋转黏度计（rotational viscometer）结合基于 pHrodo dextran 的流式细胞术定量方法，考察了生理性剪切率对血小板胞饮作用的影响。结果表明，暴露于 500–1500 s^-1 的剪切率可增强血小板胞饮作用，并提高采用 Fluo-4 测得的细胞内 Ca²⁺ 水平。应用前列腺素 E1（PGE1）抑制细胞内 Ca²⁺ 信号，以及应用乙二醇四乙酸（EGTA）螯合细胞外 Ca²⁺，均可抑制剪切诱导的 Ca²⁺ 升高和胞饮作用，提示该过程具有 Ca²⁺ 依赖性。值得注意的是，处于这一生理范围内的剪切暴露并不诱导经典血小板活化标志物，包括整合素 αIIbβ3 激活或 P-selectin 表达，提示剪切诱导的胞饮作用独立于经典活化通路发生。在无血浆条件下，即使无剪切存在，血小板胞饮作用也显著增强，且并未伴随 Ca²⁺ 升高，提示可能存在不同的血浆依赖性调控机制。综上，这些发现证明生理性剪切可通过非活化依赖性通路促进 Ca²⁺ 依赖的人血小板胞饮作用，并提示剪切调控可作为基于血细胞药物递送系统中向血小板装载药物的潜在策略。

该研究发表于《Scientific Reports》，聚焦于循环力学环境对人血小板胞饮作用（pinocytosis，液相内吞的一种形式）的调控。血小板不仅通过黏附、聚集和促凝作用参与止血，还能够通过内吞途径摄取血浆蛋白与细胞外液体内容物。因此，血小板的摄取功能既与基础生理过程有关，也与基于血细胞的药物递送系统密切相关。然而，相较于血小板分泌和经典活化机制，胞饮作用的调控规律长期缺乏系统认识，尤其是在体内始终存在的剪切流（shear flow）条件下，血小板是否会改变液相摄取能力，以及这一过程是否依赖经典活化信号，仍未被清楚界定。

研究背景在于，血小板在循环系统中持续暴露于不同水平的生理性剪切率，既往研究已提示猪血小板在 500 和 1500 s^-1 条件下可出现胞饮增强，但该结论尚不能直接外推至人血小板，而且先前采用 FITC 标记 dextran 的检测方式存在膜表面非特异黏附干扰，难以严格区分真正内吞与表面结合。此外，剪切促进胞饮的分子和信号学基础也并不清楚。基于这些问题，研究人员采用更适于反映内吞后酸性环境荧光增强特征的 pHrodo dextran，结合受控剪切加载体系，对人血小板在生理性剪切下的胞饮反应、Ca²⁺ 动力学变化及其与经典活化通路的关系进行了探索。

研究人员的核心工作是：在富血小板血浆（PRP）中，对来自健康志愿者的人血小板施加 0、500、1000 和 1500 s^-1 的剪切率，定量分析 pHrodo dextran 摄取和 Fluo-4 指示的胞内 Ca²⁺ 水平；进一步利用前列腺素 E1（PGE1）和乙二醇四乙酸（EGTA）分别抑制细胞内 Ca²⁺ 动员和细胞外 Ca²⁺ 可用性；同时检测 PAC-1 识别的整合素 αIIbβ3 活化以及 CD62P（P-selectin）表达，以判断胞饮增强是否伴随经典血小板活化；最后在洗涤血小板的无血浆条件下比较胞饮和 Ca²⁺ 变化。研究得出的主要结论是：生理性剪切率可促进人血小板胞饮，并伴随 Ca²⁺ 升高；这种剪切诱导的胞饮在 Ca²⁺ 抑制条件下被显著削弱，提示其具有 Ca²⁺ 依赖性；而在上述剪切范围内并未检测到经典活化标志物明显升高，说明该过程可独立于整合素 αIIbβ3 和 P-selectin 相关通路发生。该研究的重要意义在于，将血小板的液相摄取能力与生理性力学刺激联系起来，并为血小板作为药物载体的装载策略提供了新的调控思路。

本研究主要采用以下关键技术方法：研究对象为 6 名健康志愿者来源的人富血小板血浆（PRP）及洗涤血小板。研究人员利用锥板式旋转黏度计在 37 °C 下施加可控剪切率；使用 pHrodo dextran 作为胞饮标志物、Fluo-4 作为胞内 Ca²⁺ 荧光探针，通过流式细胞术对 10,000 个门控血小板事件进行平均荧光强度（MFI）定量；采用 PGE1 和 EGTA 进行 Ca²⁺ 抑制实验；以 PAC-1 和抗 CD62P 抗体评估经典血小板活化；统计学上使用 Friedman 检验、Dunn–Bonferroni 事后比较及 Wilcoxon 符号秩检验分析配对数据。

以下为论文结果部分的学术解读。

Shear exposure promotes platelet pinocytosis accompanied by intracellular Ca²⁺ elevation
研究人员首先利用 pHrodo dextran 评估人血小板在不同剪切率下的胞饮反应。pHrodo dextran 被细胞内吞并进入较低 pH 环境后荧光增强，因此比传统 FITC-dextran 更适于反映内化过程。结果显示，与 37 °C 静置基线相比，500、1000 和 1500 s^-1 的剪切暴露均可增强人血小板对 dextran 的摄取，提示生理性剪切范围内血小板胞饮能力上调。随后，研究人员使用 Fluo-4 检测细胞内 Ca²⁺，发现剪切条件下 Ca²⁺ 荧光强度总体升高，尽管校正后的两两比较未均达到显著性，但整体趋势一致，并且 Friedman 检验支持不同条件间存在总体差异。研究人员还通过分析前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）排除了细胞大小或内部复杂度变化导致荧光偏移的可能。该部分结果说明，生理性剪切刺激与血小板胞饮增强及胞内 Ca²⁺ 升高相关联。

Shear-induced pinocytosis is calcium-dependent and inhibited by PGE1/EGTA
为检验剪切诱导胞饮是否依赖 Ca²⁺ 信号，研究人员在 1000 s^-1 剪切条件下分别加入 PGE1 和 EGTA。PGE1 可升高细胞内环磷酸腺苷并抑制血小板 Ca²⁺ 动员，EGTA 则通过螯合细胞外 Ca²⁺ 抑制 Ca²⁺ 内流。结果表明，无论采用哪种 Ca²⁺ 抑制方式，血小板对 pHrodo dextran 的摄取均显著降低，同时 Fluo-4 所示胞内 Ca²⁺ 升高也被明显抑制。这一结果直接支持剪切促进胞饮具有 Ca²⁺ 依赖性。论文同时指出，现有实验仍无法区分剪切诱导的 Ca²⁺ 增加主要来源于胞外内流还是胞内储库释放，因此该过程的 Ca²⁺ 来源尚待进一步解析。

Shear-induced pinocytosis occurs without classical platelet activation pathways
为了判断胞饮增强是否只是经典血小板活化的伴随现象，研究人员检测了两类常用活化标志：PAC-1 识别的活化型整合素 αIIbβ3，以及 CD62P 反映的 P-selectin 表达。通过 ADP 预实验建立活化阈值后，对各剪切条件下阳性血小板比例进行了分析。结果显示，在 0–1500 s^-1 的生理性剪切范围内，无论 PAC-1 还是 CD62P，事后两两比较均未发现显著差异。尽管 CD62P 的总体检验提示条件间可能存在差异趋势，但并未形成稳定且统计学明确的逐组差异。由此，研究人员认为，剪切诱导的人血小板胞饮增强并不依赖整合素 αIIbβ3 激活或 α 颗粒释放相关的经典活化途径。该结果将“胞饮增强”与“经典激活反应”在功能层面上区分开来，提示血小板可在未发生明显传统活化的状态下调整液相摄取行为。

Plasma removal augments shear-independent pinocytosis without increasing Ca²⁺ levels
为分析血浆成分在该过程中的作用，研究人员进一步比较了 PRP 与洗涤血小板条件。在无血浆的 HEPES 缓冲体系中，即使没有剪切（0 s^-1），血小板胞饮水平也较含血浆基线上升约 5 倍；在 1000 s^-1 剪切下则进一步增加至接近 10 倍。然而，与 PRP 中观察到的情形不同，洗涤血小板在无剪切或有剪切条件下均未出现相应的胞内 Ca²⁺ 升高。该结果提示，无血浆环境下的胞饮增强可能不依赖 Ca²⁺ 上升，而是受另一种不同于 PRP 条件的调控机制支配。论文对这一现象持审慎态度，仅指出血浆成分可能同时参与促进剪切诱导 Ca²⁺ 升高和抑制胞饮，也可能影响血小板与 dextran 的接触机会；此外，洗涤过程本身也可能改变血小板状态。因此，这部分结果的意义主要在于揭示血浆环境对胞饮调控具有重要影响，并提示至少存在两种不同的调节模式。

讨论部分总结指出，本研究首次较系统地在人血小板中证明：生理性剪切率能够增强胞饮，并且这一过程与 Ca²⁺ 信号上升相伴，且可被 PGE1 和 EGTA 抑制，从而支持 Ca²⁺ 依赖性机制。与此同时，整合素 αIIbβ3 和 P-selectin 未见明显激活，说明胞饮增强并非经典血小板活化的简单衍生现象，而可能代表一种相对独立的机械敏感反应。研究人员结合既往文献认为，剪切所致 Ca²⁺ 动员可能与机械敏感 Ca²⁺ 通道或 vWF 相关过程相一致，但本研究并未直接验证具体分子。对于无血浆条件下胞饮增强而 Ca²⁺ 不升高的现象，论文认为这提示血浆在生理状态下具有双重调控作用，但目前数据尚不足以确定其精确机制。研究还坦诚指出样本量仅为 6 例，缺乏成像证据来直接显示 dextran 内吞，旋转黏度计模型也无法完全再现体内脉动流、剪切梯度、血管壁和红细胞相互作用等复杂血流环境，因此相关结论应作为探索性证据理解。

研究结论部分可译为：尽管存在上述局限性，本研究结果为人血小板剪切诱导胞饮及其与 Ca²⁺ 动力学之间的关系提供了新的认识，并提示其在基于血小板的药物递送中的潜在应用价值。未来需要通过更大样本量、多模态验证方法（如成像和信号分析）以及更接近体内条件的微流控系统，进一步证实并拓展这些发现。总体而言，本研究证明了生理性剪切可通过非经典活化依赖的方式促进人血小板胞饮，在含血浆条件下该过程与 Ca²⁺ 升高密切相关，而在无血浆条件下则可能存在不同的调控机制。这一发现不仅拓展了对血小板生物学功能的理解，也为利用机械刺激优化血小板药物装载提供了实验依据。