钼作为可降解骨植入材料在符合ISO 10993-5/-12标准的细胞相容性检测及人成骨细胞系转录组分析中的评估

《Scientific Reports》：Molybdenum as a biodegradable bone implant material assessed by ISO 10993-5/-12-compliant cytocompatibility testing and transcriptomic profiling in a human osteoblast cell line

　　

钼作为一种具有高强度机械性能、可控降解行为及耐腐蚀性的金属材料，正日益受到骨再生领域的关注。本研究采用人成骨细胞系hFOB 1.19，通过浸提液法和直接接种法两种细胞活性检测方法，严格按照ISO 10993-5/-12标准评估了金属钼的细胞相容性，以获取有价值的优质临床前数据。结果显示，钼浸提液在所有测试稀释度下均表现出较高的细胞相容性，仅未稀释浸提液使细胞存活率降至ISO 70%阈值以下，呈现出轻度浓度依赖性效应。在直接接种实验中，钼保持了与钛相当的正常细胞形态及单层完整性。相比之下，镁在两种检测模式下均诱导了明显的细胞毒性效应。所有参比材料均引发了预期反应；然而，γ射线辐照消除了含二乙基二硫代氨基甲酸锌聚氨酯的细胞毒性，凸显了考虑灭菌所致材料变化的关键重要性。补充转录组分析显示，免疫刺激性信号传导、有氧能量代谢及蛋白质生物合成相关基因集表达上调，而成骨分化标志物的表达未受损害。综合上述结果，金属钼的细胞毒性仅在毫摩尔浓度范围的浸提液中显现，从而为钼基生物材料的进一步开发奠定了可靠的临床前基础。

研究背景与科学问题

骨缺损由创伤、手术切除或感染引起，可严重损害生理功能与组织完整性，带来重大重建挑战，既需要机械稳定性又需要生物学整合。这在颅颌面（craniomaxillofacial, CMF）区域尤为突出，因为此类缺损还会损害咀嚼、吞咽和呼吸等重要功能。自体骨移植因其优异的生物学整合性仍是临床金标准，但存在供区发病率、可用性有限以及复杂几何塑形困难等局限。合成替代材料各有利弊：聚左旋乳酸（poly-L-lactic acid, PLA）具有生物可吸收性，但产生酸性降解产物引发炎症和纤维化；镁（magnesium, Mg）合金能够实现完全生物降解，其中WE43合金（含约4 wt%钇和约3 wt%钕及其他重稀土元素）已应用于获批的医疗器械如支架和骨锚钉，但其腐蚀行为难以控制，常表现为相对快速且有时局部的降解、氢气释放及局部碱度瞬时升高，可能影响机械稳定性和组织反应；钛（titanium, Ti）虽以其优异的机械强度和生物相容性广受认可，但不可生物降解，通常需要二次手术取出。目前尚无材料能同时兼具金属强度、可控吸收和良好生物学性能。

钼（molybdenum, Mo）近年成为有望弥合快速降解镁合金与不可吸收钛植入物之间差距的材料，其具有均匀生物降解和 robust 机械性能。降解后形成可溶性钼酸根离子（MoO₄^2-），经肾脏有效清除。成人血清钼浓度低于1 μg/L（<10 nmol/L），即使显著升高的全身暴露也以剂量依赖性方式经尿排泄，无临床不良效应。然而，尽管全身清除安全，植入物-骨界面的局部细胞相容性仍需专门评估，因为初始离子释放浓度可能短暂超过血浆水平并潜在损害成骨细胞功能。前期体外研究提供了鼓舞人心的初步证据：在成骨样MG63细胞中半数致死浓度（LC₅₀）超过7 mM，且相关暴露水平下未观察到显著促炎反应。体内外研究进一步支持金属钼的生物相容性，大鼠模型中组织反应良好，CMF应用前景乐观。但需注意，升高钼暴露可导致肾毒性，铜缺乏和氧化应激被讨论为潜在作用机制。重要的是，钼的细胞相容性呈浓度依赖性，对成骨细胞的细胞毒性仅在超生理钼酸盐浓度（>0.0.1 mM）时报道。前期体外研究采用非标准化暴露条件，促使研究人员开展标准化、几何控制的评估。

ISO 10993-5和ISO 10993-12提供了医疗器械提取、处理和细胞毒性检测的国际统一条件，推荐使用含二乙基二硫代氨基甲酸锌（ZDEC）或二丁基二硫代氨基甲酸锌（ZDBC）的聚氨酯及聚乙烯作为参比材料以验证检测性能。然而，金属钼尚未在这些指南下于人成骨样细胞中进行系统表征。此外，ISO 10993-12未对参比材料规定灭菌要求，这一程序缺口可能影响检测有效性和可重复性——而本研究直接解决了这两个问题。

成骨细胞作为主要的骨形成细胞和局部免疫反应调节者，是评估候选植入材料时的关键细胞类型。然而，成骨细胞对钼的分子反应仍 poorly 表征。钛表面条件下成骨细胞的转录组已有充分描述，提供了宝贵参考框架，但钼的对应数据缺失。前期巨噬细胞研究报道钼暴露后促炎细胞因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）上调，提示潜在炎症信号；但成骨细胞是否表现相似或不同的分子反应，以及由此对骨整合的后果，尚未被研究。

本研究因此追求两个互补目标：第一，使用hFOB 1.19成骨细胞，严格按照ISO 10993-5/-12进行浸提液法和直接接种法细胞毒性评估，以Ti Grade 2和WE43 Mg合金分别作为非可吸收和生物可吸收的临床对照，以ISO推荐参比材料为基准（包括灭菌效应评估），为安全规范的临床转化生成高质量、可重复的数据；第二，通过RNA测序生成直接培养于钼上的成骨细胞与组织培养聚苯乙烯对照相比的无偏、全转录组图谱，旨在识别与骨愈合和植入物安全性相关的材料诱导分子过程。

主要技术方法

本研究采用hFOB 1.19人成骨细胞系（ATCC CRL-3602），于34°C、5% CO₂条件下培养。细胞活性检测包括：基于XTT（2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-2H-四唑-5-羧酰胺）和NRU（中性红摄取）的比色法，以及直接接种法的形态学评估，均严格遵循ISO 10993-5/-12标准。浸提液按3 cm²/mL表面积体积比制备，72小时静态提取。离子浓度通过电感耦合等离子体发射光谱法（inductively coupled plasma optical emission spectrometry, ICP-OES）测定。转录组分析采用Illumina NovaSeq平台进行RNA测序（n=3生物学重复）， reads 经质控、比对至人类GRCh38参考基因组，使用DESeq2进行差异表达分析，以调整p值<0.05和|log₂折叠变化|>1为显著性阈值，基因本体（gene ontology, GO）富集分析使用ShinyGO完成。

研究结果

灭菌对聚氨酯参比材料细胞毒性的影响

为建立标准化的参比材料灭菌方案，研究人员评估了γ射线辐照、高压灭菌和乙醇处理对RM-A和RM-B细胞毒性的影响。RM-A的细胞毒性特征明显依赖于灭菌方法：γ射线辐照后的RM-A浸提液在XTT和NRU检测中所有测试浓度（12.5–100%）的细胞存活率接近100%，无活性降低，表明细胞毒性活性完全消除；而高压灭菌和乙醇处理的RM-A浸提液诱导浓度依赖性的细胞存活率下降，高浓度效应更明显。RM-B则无论采用何种灭菌方法，细胞毒性特征均相当。这些结果表明，γ射线辐照选择性地消除了RM-A的细胞毒性活性，而RM-B的细胞毒性特征基本不受灭菌程序影响，凸显了在使用参比材料进行标准化细胞毒性检测时灭菌方法选择的重要性。

钼在浸提液法和直接接种法中的细胞相容性

研究人员评估了钼酸钠和金属钼的细胞相容性。钼酸钠在毫摩尔浓度范围内诱导浓度依赖性的活力降低，XTT和NRU检测的LC₅₀值分别为9.3 mM和9.1 mM。在浸提液实验中，金属钼表现出高细胞相容性，浓度高达50%时活力维持于ISO 10993-5阈值以上，仅未稀释的100%浸提液使活力中度降低至70%阈值或略低，对应ICP分析测定的钼浓度为2.3 ± 0.3 mM（219 ± 28 mg/L）。阴性参比材料RM-B诱导明显的浓度依赖性活力降低，100%浸提液时接近完全丧失代谢活性。在低浓度（12.5%和25%）时钼与RM-B无显著差异，但在100%浸提液时钼显著更高活力。NRU检测呈现一致趋势。直接接种实验结果一致：培养24小时后，金属钼上的hFOB 1.19细胞保持贴壁良好，显示典型成骨样形态，形成连续单层，与RM-C相当，对应ISO 10993-5的0级细胞毒性；而RM-A诱导明显的形态学改变，包括细胞变圆、脱离和单层破坏，提示严重细胞毒性（4级）。

钼、钛和镁的比较细胞毒性评估

研究人员通过浸提液法和直接接种法比较了钼、钛和镁在hFOB 1.19细胞中的细胞毒性反应。浸提液检测中，钛在所有测试浓度下均维持高细胞活力，未检测到细胞毒性效应。镁浸提液诱导明显的浓度依赖性活力下降，50%和100%浓度时降至ISO 10993-5阈值70%以下。钼显示中等反应：较低浸提液浓度时活力维持70%以上，100%时中度降低至约60%。所有浓度下钼始终比镁具有更高活力。pH测量显示，钼、钛、RM-B和RM-C的pH值维持在约7.5–7.9的狭窄范围；而镁浸提液显示更高pH值（100%和50%分别为8.1和8.4），表明镁使浸提液碱化更强。

直接接种检测中，无论是否预培养，钛和钼均支持24小时后完整的融合细胞单层，细胞维持正常成骨样形态和稳定贴附，对应ISO 10993-5的0级。相反，镁导致细胞密度降低、部分（预培养）或完全（未预培养）脱离及单层破坏，提示严重细胞毒性（4级）。预培养材料的直接接种检测除镁外结果相当，表明预培养未实质性影响所测试条件下的细胞毒性反应。

hFOB 1.19对钼反应的转录组图谱

为深入表征金属钼与成骨细胞的相互作用，并调查高钼浸提液浓度下观察到的轻度细胞毒性反应背后的分子过程，研究人员对直接培养于钼板上24小时的hFOB 1.19细胞进行了RNA测序分析，与标准组织培养聚苯乙烯上的细胞进行比较。

从钼和塑料上培养的细胞分别获得平均24.6 ± 0.7和22.7 ± 0.7百万条reads。其中96.55 ± 0.08%和98.83 ± 0.09%唯一比对至人类参考基因组。主成分分析确认了各组内生物学重复的一致聚类。在检测到的14,928个基因中，89个在严格标准下显著差异表达（调整p < 0.05，|log₂折叠变化| > 1），包括62个上调和27个下调基因。上调基因集的GO富集分析鉴定出14个富集的生物学过程术语，大致分为三个功能类别：免疫反应、线粒体活动和蛋白质生物合成；下调基因集返回20个富集的生物学过程术语，主要与成骨信号、增殖和分化相关。

为深入检查对骨形成功能的影响，对"骨化"术语进行了GO富集分析，返回43个差异表达基因（调整p < 0.05），其中26个下调和17个上调。重要的是，经典成骨标志物——包括RUNX2、COL1A1、COL3A1、ALPL、SPP1（骨桥蛋白）、BGLAP（骨钙蛋白）和TNFSF11（RANKL）——均未差异表达，提示在测试条件下核心成骨细胞特性和基质形成能力得以保留。

讨论与结论

本研究在ISO 10993-5和ISO 10993-12标准化条件下评估了钼的细胞毒性，并通过转录组分析进行了补充。浸提液检测中，钼在所有稀释度（12.5%、25%和50%）下均支持高细胞活力。100%浸提液浓度时活力降至约60%，低于70%的细胞毒性阈值，表明轻度细胞毒性而非完全丧失代谢活性或膜完整性。研究人员推测，观察到的活力降低可能归因于先前在肝细胞和上皮细胞中描述的钼暴露后的氧化应激，和/或植物细胞中观察到的遗传毒性。直接接种检测中，钼 adjacent 细胞维持正常形态和完整单层24小时，符合非细胞毒性反应。这些发现与先前将钼归类为细胞毒性最低的植入相关金属之一的报告一致，在其他人成骨细胞模型中LC₅₀值超过7 mM，亚毒性浓度下无显著促炎细胞因子释放。本研究中钼酸钠在hFOB 1.19细胞中产生可比的LC₅₀值，表明对其他成骨细胞系具有相似的钼酸根离子敏感性。100%浸提液时的轻度活力降低可能反映了静态提取条件下钼酸盐的积累，因为72小时孵育期促进了比动态体内环境（连续液体清除）更高的局部离子浓度，而动态体内环境中已报告了良好的组织相容性。ICP-OES证实72小时浸提液中钼酸盐浓度约2.3 mM，与观察到的活力降低一致，提示该浓度范围为标准化条件下的相关细胞相容性边界。除钼酸盐离子外的额外因素可能促成钼浸提液中观察到的细胞毒性，因为单独的2.4 mM钼酸盐浓度预计仅将细胞活力降低至约80–90%。

比较评估凸显了清晰的材料特异性行为。钛在所有检测浓度下维持高活力和细胞形态，与其已建立的生物相容性一致。镁表现出明显的浓度依赖性细胞毒性，归因于快速降解相关的pH升高和离子强度增加。钼显示中等生物学特征，直接接种时的细胞反应更接近钛而非镁。镁的极端细胞毒性效应也说明了标准化体外检测用于快速降解金属的公认局限性，其浸提液可能达到体内不可能发生的非生理性离子浓度。所有结果应在标准化检测的既定框架内解读，寻求实现更生理相关条件的方法。

关于γ射线辐照对标准化聚氨酯参比材料的影响，灭菌后的强细胞毒性参比（RM-A）丧失了预期生物学活性，证明辐照可改变材料性质并混淆细胞毒性评估。这强调了在特定研究应用的灭菌条件下验证参比材料性能的重要性。

在钼底物上培养的细胞中，转录组分析揭示了免疫相关基因本体术语的强烈富集，特别是"抗微生物肽介导的抗微生物体液反应"和"粒细胞趋化调节"。这些集合中的关键上调基因包括TNFAIP6、IL34、CXCL8和CXCL10，编码调节多种免疫细胞群体的细胞因子。IL34和TNFAIP6均为骨稳态的已确立调节因子，具有依赖于环境的破骨细胞激活、分化和成骨作用角色；CXCL8是趋化因子，其上调已被证明通过IL-6信号增强成骨细胞介导的破骨细胞生成。免疫反应基因的上调与巨噬细胞研究报道的钼接触后促炎介质表达增加一致。然而，急性炎症标志物如IL-1β和IL-6未显著上调，表明受控的信号反应而非急性炎症反应。

同时，编码电子传递链组分（包括细胞色素c氧化酶）的线粒体基因上调，以及细胞质翻译术语的富集，指向有氧能量产生和蛋白质生物合成能力的增强。

下调基因中，最强烈富集的GO术语包括"G蛋白偶联血清素受体信号通路"、"肥大细胞迁移"和"肥大细胞趋化"。在"G蛋白偶联血清素受体信号通路"术语中，HTR7和CHRM2显著下调；CHRM2是胆碱能信号系统的组成部分，已被鉴定为骨重塑和成骨细胞增殖的调节因子。在驱动"肥大细胞迁移"和"肥大细胞趋化"富集的基因中，KIT和PGF显著下调；KIT编码干细胞因子的受体酪氨酸激酶，参与多种细胞类型的增殖、分化和迁移调节；PGF编码已知受成骨形态发生蛋白BMP-2调节的生长因子。这些信号相关基因的集体下调提示钼接触后成骨细胞增殖能力降低，而——如上所述——核心成骨标志物未受影响，表明基本骨形成功能保留。

钛作为基准植入材料，其成骨细胞转录反应已被广泛表征。先前研究报告关键成骨分化标志物的持续表达，如骨钙蛋白、osterix、骨桥蛋白和I型胶原，以及保留的矿化能力。同样，本研究中钼未显著改变成骨标志物基因的表达，表明与该材料接触时细胞外基质生物合成能力得以保留。为与直接接种活力检测保持一致，研究人员采用了24小时孵育期，这可能不足以检测RUNX2和ALPL等成骨分化标志物的变化。需要更长孵育时间的随访研究结合额外生化检测，以调查钼暴露的长期细胞反应。

总之，钼在标准化ISO 10993-5/-12条件下表现出高细胞相容性，细胞毒性效应局限于毫摩尔浓度范围的钼酸盐。与钼直接接触的成骨细胞转录组分析提示免疫刺激性信号增强以及有氧能量代谢和蛋白质生物合成增强，而成骨分化标志物表达未受损害。综合而言，这些发现为将钼作为骨腔室植入应用的生物可吸收金属材料进一步评估提供了可靠的临床前基础，同时强调植入物-组织界面的局部钼酸盐离子浓度必须保持在细胞毒性阈值以下以确保生物相容性。