用于抑制金黄色葡萄球菌的等离子体活化水凝胶的合成、表征、保质期及工艺参数优化

《Scientific Reports》：Synthesis, characterization, shelf life and optimization of process parameter of plasma-activated hydrogel production for Staphylococcus aureus Inhibition

　　

该研究优化了等离子体活化水凝胶（plasma-activated hydrogel, PAH）作为一种无化学试剂抗菌剂用于动物皮肤金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）感染的应用，以应对抗生素耐药性（antibiotic resistance）和慢性伤口问题。等离子体活化水（plasma-activated water, PAW）通过生成活性氧氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, RONS）提供无化学试剂的抗菌活性，而PAH则延长了稳定性并改善了对不规则伤口表面的应用效果。研究采用析因设计（factorial design）评估了PAW处理时间（0–20 min）和水凝胶比例（1:5–3:5 w/v）对氧化还原电位（oxidation-reduction potential, ORP）、电导率（electrical conductivity, EC）、pH及H₂O₂的影响，所有测试均进行三次重复。较长的PAW暴露时间使ORP从385.97 mV降低至278.90 mV，并将pH降至5.17，而两个变量均使EC升高（最高达263.75 μS/cm），反映了活性物种的增加以及EC/ORP的非线性行为。最优条件为3:5凝胶比例与20分钟PAW处理，所得ORP为278.90 mV、EC为263.75 μS/cm、pH 5.325、H₂O₂ 29.38 ppm。动力学研究表明，PAH中H₂O₂的衰减速率慢于PAW，冷藏条件下4周后仍可维持约10.6 ppm。优化后的PAH实现了约9.5 log₁₀ CFU/mL的金黄色葡萄球菌减少量，显示出在兽用伤口护理应用中的广阔前景。

兽医学领域中，伴侣动物及 livestock（家畜）的伤口管理长期面临临床与经济双重负担。皮肤损伤的病理生理过程复杂，加之抗菌素耐药性日益削弱标准治疗方案的有效性，这一问题与食品动物生产系统中耐药病原体威胁产品安全与质量的报道相互呼应。此外，受损皮肤的修复需经历止血、炎症、增殖和重塑等阶段，但当伤口被细菌定植或感染时，这一序列常被中断，导致愈合延迟、恶臭加重，甚至在某些情况下产生人畜共患病风险。现行 Protocols（方案）通常联合清创、保湿敷料及局部或全身抗菌药物，但生物膜形成、灌注不良以及药物在重度污染或失活组织中效能有限等问题频繁导致疗效不佳，这促使研究人员将目光投向能在不损害生理愈合的前提下抑制感染的局部疗法。

传统化学制剂，特别是抗生素和防腐剂，仍是大多数兽用伤口处理方案的基石，但因其耐药选择压力、毒性和环境问题而日益被视为"双刃剑"。伴侣动物和 livestock 中抗生素的广泛使用助长了多重耐药细菌的蔓延，而含硫、水杨酸或氯己定等常见局部制剂则可能刺激皮肤、扰乱常驻微生物群并降低依从性。类似地，在食品加工环境中，食源性及腐败菌反复暴露于杀菌剂后也记录了耐药性和微生物群扰动模式。杀菌剂耐受亚群的出现、交叉耐药性以及药物向缺血或纤维化伤口床渗透不佳等问题进一步限制了疗效，这强化了在"同一健康"（One Health）框架下减少传统抗生素依赖的无化学试剂或低残留方法的必要性。

在此背景下，无化学试剂抗菌策略作为标准化合物在人和兽医医学中的辅助或替代方案日益受到关注，其目标是在保持抗菌活性的同时降低毒性和生态影响。非热等离子体（non-thermal plasma, NTP）尤为引人注目，因其能生成多种活性氧氮物种（RONS），可在不留持久性合成残留的情况下灭活微生物，且多项研究表明其还对伤口修复具有额外益处，包括调节炎症、促进血管生成和加速再上皮化。除直接气体等离子体应用外，等离子体衍生液体——最著名的是等离子体活化水（PAW）——已成为实用载体，能在放电过程中捕获长寿命活性物种，并可在使用前储存、运输，用作冲洗液、喷雾剂或高级敷料的组分，类似于其在食品系统中作为非热去污介质的使用。这些新兴的无化学试剂抗菌方法还与联合国可持续发展目标（SDGs）相契合，支持抗菌药物的负责任使用、保障动物和公共卫生并减少环境污染。

在小动物皮肤病学中，皮肤感染常为 polymicrobial（多微生物）感染，以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌和变形杆菌属等 opportunists（机会性病原体）为主，这些微生物易定植于受损皮肤、形成生物膜并传播耐药基因。慢性皮炎和表面脓皮症常以皮脂溢、鳞屑、瘙痒和恶臭为特征，尽管药用香波和喷雾剂广泛使用，但可能刺激皮肤且难以穿透富含生物膜或大量渗出的病变，而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和伪中间葡萄球菌进一步复杂了药物选择。在此背景下，PAW具有吸引力，因其可配制成冲洗液、喷雾剂或湿敷料，贴合不规则体表区域，直接向感染皮肤递送RONS，其作用方式与抗生素不同，因此较不易受现有耐药机制影响。

PAW对金黄色葡萄球菌的活性得到大量体内外研究的支持，这些研究一致报告在适当活化条件下10–20分钟内可实现≥4–5 log的减少量，并将杀菌作用与酸化、氧化环境联系起来，该环境可导致膜破坏、细胞内成分泄漏、蛋白质氧化和DNA损伤。生物膜模型研究表明，PAW可减少生物量、破坏胞外基质并增强与抗生素联合使用的敏感性，而在纺织品及其他多孔材料上的实验表明，其还可对兽医用敷料和环境污染物进行去污。然而，PAW的实际应用受其活性物种有限稳定性的制约：即使冷藏或避光保存，pH、ORP和H₂O₂含量等参数常在数小时至数天内漂移，导致抗菌效力逐渐丧失，这就需要现场生产或严格控制的物流保障。

延长活性的同时，PAH在兽医环境中还具有若干实用优势。三维凝胶结构可贴合爪、耳廓及皮肤皱褶等不规则且活动的部位，改善与生物膜的接触、吸收渗出液并保持表面湿润，且PAH还可与超声或微/纳米气泡等物理辅助手段联合，以增强传质并提高对MRSA和铜绿假单胞菌的杀灭效果。由于PAH制剂可提前制备和储存，其还绕过了诊所等离子体系统的需求，为常规实践和农场使用提供了即用型敷料或贴片的可能性。

基于此，本研究追求四个主要目标：（i）量化凝胶比例和PAW处理时间对明胶基PAH的pH、EC、ORP和H₂O₂含量的影响；（ii）比较控制的储存条件下PAH和PAW中H₂O₂的短期和长期稳定性；（iii）将这些理化性质与实验室模型中金黄色葡萄球菌ATCC 6538的灭活效果相关联，该模型与动物皮肤感染相关；（iv）确定一个将强抗菌活性与适合皮肤接触使用的理化条件相结合的操作窗口。该研究通过四项综合贡献推动了该领域的发展：系统地采用双因素三水平析因优化PAW处理参数和凝胶配方以获得抗菌PAH；全面平行表征控制的储存条件下PAW和PAH基质中的理化稳定性（pH、EC、ORP、H₂O₂动力学）；直接定量比较液相和凝胶相之间H₂O₂的保留率和衰减速率，揭示稳定机制；将这些数据整合到专门为兽医皮肤病学应用设计的明胶基平台中。与以往单独研究PAW或PAH或关注单一响应的研究不同，该析因方法明确将配方参数与即时抗菌功效和延长保质期之间的权衡联系起来，为血浆活化生物材料的理性设计用于伤口护理提供了实用框架。

该研究为受控实验室研究，采用双因素三水平析因设计并复制中心点，系统评估凝胶比例和PAW处理时间对关键理化性质和抗菌性能的影响。因素A对应明胶基水凝胶比例（1:5、2:5和3:5 w/v），因素B对应PAW处理时间（0、10和20 min），0 min处理水平对应使用非活化蒸馏水（无等离子体处理）制备的水凝胶，作为负对照以分离等离子体特异性效应与基质相关效应。过程响应包括pH、ORP、EC、H₂O₂浓度和金黄色葡萄球菌的log₁₀减少量，通过多重响应优化确定同时最大化氧化电位和EC、最小化pH的条件。研究使用的关键设备包括：基于纳米气泡增强的非热大气压PAW反应器（单电极水下等离子体系，DC电源，30 W功率，25°C，压缩空气1.0 L/min，微气泡扩散器）；用于H₂O₂定量分析的钛-硫酸溶液比色法；以及用于金黄色葡萄球菌计数的3M Petrifilm Staph Express计数平板。

主要研究结果如下：

**PAH的pH理化性质：** 所有水凝胶的pH均高于对照PAW但仍明显酸于自来水基配方，表明聚合物网络具有部分缓冲作用但未完全丧失等离子体诱导的酸度。最高pH（6.72）出现在最低凝胶比例且无额外PAW处理时，最低pH（5.17）出现在最高凝胶比例与延长PAW处理结合时（G3:5 g/20 min）。析因分析证实PAW处理时间是主要决定因素，凝胶比例产生较小、边缘显著的额外降低，交互作用不显著。

**PAH的EC理化性质：** EC随PAW处理时间和凝胶比例系统增加，表明离子物种的渐进积累。最高凝胶比例和最长活化时间组合产生最大值263 μS/cm，中心点条件（中等凝胶比例和活化时间）产生与基础对照PAW相近的EC值（148–150 μS/cm）。回归分析证实两个因素均显著独立贡献于EC，处理时间效应更大。

**PAH的ORP理化性质：** ORP呈现复杂依赖性。纯对照PAW的ORP为314.00 mV，显著高于自来水（284.00 mV）。最短活化时间（0 min）时，增加凝胶比例使ORP从351.67 mV升至385.97 mV；最长活化时间（20 min）时，ORP显著降至282.03 mV和278.90 mV，甚至略低于纯对照PAW。回归分析显示因素B具有显著稳健的负效应，且存在显著的凝胶比例×活化时间负交互作用。

**多响应优化：** 采用合意函数（desirability function）最大化ORP和EC同时最小化pH，确定高-高条件（A=+1, B=+1，即G3:5 g/20 min）为最佳折中，预测ORP 278.90 mV、EC 263.75 μS/cm、pH 5.325，综合合意性得分0.692545。

**H₂O₂稳定性及保质期评估：** 72小时动力学研究显示PAH中H₂O₂呈伪一级反应动力学衰减，速率常数k=0.035±0.002 h^?1，半衰期19.8小时，最终达到约0.15 mM的稳定低平台浓度。4周冷藏储存研究显示PAH中H₂O₂衰减速率慢于PAW，4周后仍可维持约10.6 ppm，而PAW中H₂O₂下降更快。

**H₂O₂一级衰减动力学和PAH稳定性：** 使用单一级（SFO）动力学模型拟合，决定系数R2=0.992，初始浓度C₀为33.00±0.35 ppm，衰减速率常数k=0.0195±0.0009 min^?1，半衰期35.54 min。

**金黄色葡萄球菌存活抗菌功效：** 析因分析确认凝胶比例、PAW处理时间及其交互作用均显著影响抗菌功效（p<0.05）。所有回归系数为负，表明较低凝胶比例和较长PAW处理时间有利于更高的log₁₀减少量。最大减少量约9.5 log₁₀ CFU/mL出现在最低凝胶比例（1:5）和低编码因子水平处，且沿B=?1线基本独立于PAH处理时间。最优条件为A=?1, B=?1（9.52 log₁₀ CFU/mL）。

**讨论：** 本研究表明，基于纳米气泡辅助PAW和明胶基质的PAH可经过理性调控，获得与兽医伤口管理高度相关的理化条件和抗菌性能，同时凸显稳定性与杀菌效果之间的重要权衡。PAW处理时间和凝胶比例是控制pH、EC、ORP、H₂O₂含量和金黄色葡萄球菌灭活的主导杠杆，处理时间通常效应更大。

pH结果表明PAH可被稳定定位在轻度酸性范围，有利于抗菌活性和皮肤相容性。最高凝胶比例和最长PAW活化时间产生最强酸化效果，这与非热等离子体液体化学的当前理解一致，即延长暴露促进硝酸、亚硝酸形成和质子生成RONS的积累。优化PAH中实现的微酸性环境与其他等离子体处理敷料相当，与增强杀菌作用和改善伤口愈合动力学相关。

EC的显著增加证实水凝胶作为溶解离子和活性物种密集储库的作用。最高EC值几乎达到母体PAW的两倍，回归模型揭示高度显著的正主效应和明显曲率。由于EC升高与PAW对食源性和临床病原体抗菌效力的增加相关，本数据表明明胶基PAH可被工程化以在延长接触时间内提供高但可控的生物活性离子浓度。

ORP表现更为复杂。零或短活化时间时，增加凝胶比例导致更高ORP；但延长活化时ORP显著下降。尽管延长等离子体暴露通常增加水相系统中的氧化物种，但水凝胶基质中观察到的ORP降低提示存在次级基质介导反应。可能的机制解释是延长处理使RONS物种向更稳定但氧化性较弱的离子（如硝酸根）转移，并促进高能自由基在凝胶化过程中与明胶的重组反应和消耗。这些反应可生成还原或中性产物以及共价结合的氧化残留物，降低净ORP尽管总RONS负荷较高。因此，一旦PAW固定于水凝胶中，ORP、pH和EC便不可互换作为活化强度的替代指标，强化了多参数表征等离子体衍生生物材料的必要性。

金黄色葡萄球菌的抗菌响应反映了这种复杂的理化格局，并揭示了即时杀菌效果与为稳定性优化的理化条件之间的关键权衡。最大灭活约9.5 log₁₀ CFU/mL出现在最低凝胶比例（1:5），这与理化优化中高凝胶比例（3:5）和延长活化产生最理想分布形成鲜明对比。这种分歧表明，H₂O₂浓度和离子强度的总体测量并非PAW固定于致密水凝胶基质后抗菌性能的唯一决定因素。低凝胶比例的优越灭活可能反映了更有利的RONS传质条件，特别是短寿命自由基，其对膜和DNA损伤贡献不成比例。较低交联密度和更多自由水的1:5网络增强了活性物种向细菌细胞的扩散，与3:5凝胶形成对比。这支持了最优等离子体衍生生物材料需要耦合ROS生成、保留和传输三个维度而非简单最大化任何单一理化指标的观点。

动力学和保质期数据进一步强化了水凝胶固定化相对于游离PAW的优势，同时阐明了当前配方的局限性。冷藏储存下，PAH中H₂O₂衰减更慢，4周后保留约10.6 ppm，而PAW中下降更快。这通常归因于聚合物微域内扩散系数降低和H₂O₂屏蔽作用，减少了与催化杂质和分解界面的 encounters。该结果证实明胶基PAH可作为有效稳定基质，实现等离子体活化制剂的预制和储存，解决了PAW文献中突出强调的主要实际障碍。同时，抗菌响应中检测到的强曲率表明当前一阶交互模型为近似，需要全二次设计以更精确定义全球最优和安全有效操作边界。

该工作在更广泛的等离子体医学和兽医伤口护理文献中的贡献包括：首次将双因素三水平析因设计与PAW和PAH的详细理化及动力学表征相结合，明确将pH、EC、ORP和H₂O₂动力学与金黄色葡萄球菌灭活相关联于单一实验框架；纳米气泡辅助放电系统的使用可能增强了气液传质和RONS生成；针对兽医皮肤应用的明胶平台的特定靶向解决了临床相关细分领域。局限性包括实验设计范围相对狭窄、缺乏关键RONS的直接物种分析、仅使用体外模型未评估哺乳动物细胞毒性或真实组织上的生物膜破坏、未进行离体或体内伤口模型评估等。

**研究结论：** 本研究表明，通过将纳米气泡辅助非热等离子体反应器生成的PAW整合到明胶基基质中生产的PAH，为动物皮肤病原体控制提供了一种可调控的平台。析因设计和响应面分析确定PAW处理时间和凝胶比例为控制PAH理化性质的主要变量，处理时间对pH、ORP、EC、H₂O₂保留和金黄色葡萄球菌log₁₀减少量具有主导影响。处理时间与凝胶比例之间存在统计显著的交互作用，在较高凝胶比例时处理时间对抗菌功效的影响更为显著，表明存在协同调制而非独立加性效应。多响应优化揭示高凝胶含量结合延长等离子体活化产生轻度酸性、富离子且充分氧化的水凝胶，在最大化抗菌功效的同时保持在生物学可接受范围内。综合而言，这些结果表明等离子体活化水凝胶可被工程化以结合大量金黄色葡萄球菌灭活与可调控理化性质及相对于单独PAW的延长H₂O₂保留。在研究的因素空间内，最高凝胶比例和最长PAW处理的条件最大化稳定性相关参数，而最低凝胶比例在延长处理时提供最强抗菌效果，凸显了保质期和即时杀菌性能之间的基本权衡。鉴于当前工作仅限于金黄色葡萄球菌的体外检测和理化表征，在将PAH作为兽用伤口敷料进行临床转化之前，还需要在离体或体内伤口模型以及更广泛的细胞相容性测试中进行进一步研究。