《Scientific Reports》：Autofluorescence spectroscopy and multispectral autofluorescence microscopy for characterization of lupus nephritis in renal tissues
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本研究旨在无标记模式下，利用同步自发荧光（AF）光谱与多光谱自发荧光显微成像技术对狼疮性肾炎（LN）进行研究。狼疮性肾炎是一种自身免疫性疾病，蛋白尿是其最典型的症状及肾损伤与疾病活动的指标。研究开发了微型光谱内窥镜（MSE）并应用于小鼠LN肾组织，涵盖三个疾病
本研究旨在无标记模式下，利用同步自发荧光（AF）光谱与多光谱自发荧光显微成像技术对狼疮性肾炎（LN）进行研究。狼疮性肾炎是一种自身免疫性疾病，蛋白尿是其最典型的症状及肾损伤与疾病活动的指标。研究开发了微型光谱内窥镜（MSE）并应用于小鼠LN肾组织，涵盖三个疾病阶段：晚期终末期（蛋白尿期）、早期发病期（抗体阳性期）以及无疾病表现的健康期（幼年期）。该微型光谱内窥镜利用365 nm和405 nm两个激发波长探测内源性自发荧光活性。采用365 nm发光二极管（LED）进行的多光谱自发荧光显微成像从三个光谱带收集信息：440–490 nm、500–560 nm及600–650 nm。研究人员对髓质、髓质-皮质交界处及皮质三个区域进行了自发荧光显微成像观察，其中皮质区域记录到最强的自发荧光。同步采集自发荧光光谱与显微成像可从同一组织位置获取分子与形态学信息。研究人员使用405 nm LED激发的微型光谱内窥镜记录了蛋白尿期、抗体阳性期及幼年期小鼠肾组织的同步自发荧光显微图像与光谱。观察到三组样本的自发荧光光谱峰值发生显著变化：蛋白尿期约~480 nm、抗体阳性期约~493 nm、幼年期约~532 nm。自发荧光峰值的交替变化可能源于疾病进展过程中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）荧光团的变化。此外，在抗体阳性组织中还观察到约~616 nm的额外峰值，显示脂褐素的存在，而该成分在幼年和蛋白尿组织中缺失，提示溶酶体活性增加和氧化应激的可能性。
## 研究背景与问题
系统性红斑狼疮（SLE）是一种自身免疫性疾病，当其主要累及肾脏时即称为狼疮性肾炎（LN）。LN最常见的临床表现是蛋白尿，后者作为肾损伤和疾病活动的生物学标志物，被视为SLE疾病活动的标志性指标。LN的进展可导致慢性肾脏病（CKD），其病理基础为间质和肾小管纤维化。随着全球CKD病例的增加以及终末期肾衰竭需肾脏替代治疗患者数目的上升，该疾病已成为日益严峻的公共卫生问题。CKD的进展主要与抗核抗体（ANAs）水平升高有关，ANAs是针对细胞核内多种成分的自身抗体，包括蛋白质、DNA、RNA及核酸-蛋白质复合物。
目前LN的标准诊断程序包括ANA血液检测、尿液分析、组织活检和MRI扫描等，其中肾活检是确诊和评估疾病进展的主要依据，但该程序耗时较长且具侵入性。光学方法如自发荧光（AF）显微成像和AF光谱作为一种非侵入性、非接触式技术，可实现实时在体疾病诊断和筛查，正逐渐成为颇具前景的替代手段。尽管已有研究将内窥镜技术用于自身免疫性疾病的诊断，但针对LN等自身免疫性疾病的微型内窥镜诊断研究仍相对匮乏。现有微型内窥镜系统往往光学元件众多、结构复杂，且尚未有研究将AF显微成像与光谱技术整合于统一平台用于LN肾组织评估。
## 主要技术方法
研究人员开发了一种基于梯度折射率（GRIN）棒透镜的微型光谱内窥镜（MSE），直径2 mm，工作距离5 mm，空间分辨率达4.92 μm。该系统采用45度倾斜背向照明设计，集成365 nm和405 nm两个LED激发光源，通过50:50分束器将信号分为成像臂和光谱臂，实现同步AF显微成像与光谱采集。多光谱AF显微成像采用365 nm激发，配合三个带通滤波器（蓝色450–490 nm、绿色510–560 nm、红色600–650 nm）采集不同光谱带的AF图像；同步AF光谱与显微成像则采用405 nm激发及>425 nm长通滤波器。
样本队列来源于美国Jackson Laboratories的狼疮易感MRL/MpJ-Faslpr/J（MRL-lpr）品系小鼠，该品系可自发产生类似人类LN的系统性自身免疫和免疫复合物性肾小球肾炎。研究纳入5只蛋白尿期小鼠（20周龄，尿蛋白≥20 g/L）、5只抗体阳性期小鼠（12周龄，抗dsDNA抗体阳性）和6只幼年期小鼠（4周龄，无疾病表现），共计16例。肾组织经福尔马林固定后制备为10 μm厚切片，分析髓质、髓质-皮质交界处和皮质三个区域。图像处理与统计分析采用MATLAB R2024b软件，运用双因素方差分析（ANOVA）及Tukey's HSD事后检验评估统计学差异。
该研究发表于《Scientific Reports》。
## 研究结果
**365 nm自发荧光显微成像分析：** 研究人员首先使用365 nm激发对三类小鼠肾组织进行AF显微成像。结果显示，蛋白尿期和抗体阳性期组织的AF强度均高于幼年期组织。抗体阳性和蛋白尿小鼠肾小球及肾小管间质区域均有抗dsDNA抗体沉积。由于在肾近曲小管中存在大量线粒体，而后者产生的NADH和FAD是AF信号的主要来源，因此疾病状态下代谢改变可影响AF强度。在疾病终末期，由于氧化应激和炎症导致PARPs和CD38等酶消耗更多NAD?，加之 Salvage 通路和从头合成途径受损，NAD?水平下降，导致AF信号降低。此外，肾脏皮质主要含肾小球和近曲小管，富含胶原且AF高于背景组织，这与各MRL品系实验观测结果一致。
**不同肾区域的AF显微成像：** 研究人员进一步分析了髓质、髓质-皮质交界处和皮质三个区域的AF特性。在所有分析区域中，蛋白尿期组织均显示增强的AF。髓质区域在蛋白尿期和抗体阳性期均较幼年期显示更多AF，可能与NADH和胶原浓度变化有关。皮质区域在组织切片边缘显示增强AF，可能源于肾囊包围的脂肪酸层代谢活性差异。统计结果显示，组织区域因素贡献了59.24%的总变异（F(2,90)=133.88, p<0.0001），分组因素贡献18.29%（F(2,90)=41.35, p<0.0001），两者的交互作用亦显著（F(4,90)=2.95, p=0.0243）。事后分析表明，皮质区域蛋白尿期与幼年期（p<0.0001）、蛋白尿期与抗体阳性期（p<0.001）差异显著；髓质区域蛋白尿期与幼年期（p<0.0001）、抗体阳性与幼年期（p<0.0001）差异显著。总体而言，蛋白尿期小鼠在各区域均表现最高AF，尤以皮质和髓质最为突出。
**多光谱自发荧光显微成像：** 研究人员选择皮质区域进行多光谱AF分析，因该区域含肾单位且受疾病进展影响显著。使用365 nm激发配合三个带通滤波器采集图像。蓝色光谱带（450–490 nm）显示蛋白尿期组织AF强度最高，提示NADH存在；绿色光谱带（510–560 nm）显示抗体阳性期AF最高，反映FAD和黄素蛋白（FP）水平升高，与自身抗体沉积、免疫细胞浸润增加及近曲小管物质摄取改变有关；红色光谱带（600–650 nm）在幼年和抗体阳性组织边缘显示AF，提示较高卟啉摄取。双因素ANOVA显示组别与组织区域交互作用显著（F(4,228)=5.85, p=0.0001），组别和区域主效应均显著。Tukey's检验表明，蓝色滤光片下幼年组显著低于抗体阳性组（MeanDiff=-20.01, p<0.0001）和蛋白尿组（MeanDiff=-22.31, p<0.0001）；绿色滤光片下幼年组同样显著低于抗体阳性组（p=0.0165）和蛋白尿组（p=0.0009）；红色滤光片下仅抗体阳性与幼年组差异显著（MeanDiff=-12.54, p<0.0001）。
**同步自发荧光光谱与显微成像：** 采用405 nm激发进行同步AF光谱和显微成像，以探测组织中的卟啉。在长通滤波器（>425 nm）下，205条光谱显示蛋白尿期、抗体阳性期和幼年期AF光谱峰值分别位于~493 nm、~480 nm和~536 nm，对应FAD表达变化。值得注意的是，抗体阳性期样本在~616 nm出现新峰，提示脂褐素存在，反映溶酶体活性增加和氧化应激。峰值位移可能源于荧光团浓度变化：抗体阳性期光谱峰约~480 nm，较蛋白尿期（~493 nm）和幼年期（~536 nm）蓝移，可能由NADH-FAD、脂褐素及其他荧光团浓度差异所致。
## 讨论与结论
研究人员在讨论中指出，多光谱AF显微成像显示不同疾病阶段肾组织具有各异的AF信息，同步光谱显示各阶段最大峰值位移，主要源于内源性荧光团浓度变化。抗体阳性组织光谱中约530 nm处出现隆起，可能与溶酶体活性增加和氧化应激有关。本研究局限性在于观测到的AF代表多种内源性荧光团（NADH、FAD、脂褐素、胶原、卟啉等）的总发射，未进行荧光团特异性生化验证，因此分子信息为推断性而非确定性。尽管所有比较分析在严格相同和受控的实验条件下进行，支持不同组织间可靠的AF比较，但未来仍需通过互补分子或生化检测加以确认。此外，本研究聚焦于MRL-lpr组织，其人类适用性尚需在人LN组织中进行专门验证。
研究结论部分总结道：本研究展示了针对蛋白尿期、抗体阳性期和幼年期肾组织的AF光谱和多光谱AF显微成像。研究使用开发的微型光谱内窥镜在体外模式下检验了16例样本。365 nm激发波长用于AF显微成像和多光谱显微成像，在髓质、髓质-皮质交界处和皮质区域的AF显微成像显示，所有病例中皮质AF最高。在皮质区域，多光谱分析显示蛋白尿期和抗体阳性期组织绿色波段AF增强，源于FAD和黄素蛋白升高。405 nm激发波长用于同步AF光谱和显微成像，皮质同步AF光谱和显微成像显示蛋白尿期、抗体阳性期和幼年期组织的峰值分别位于~480 nm、~493 nm和~532 nm，由NADH和FAD浓度变化所致。此外，抗体阳性期约~616 nm处出现新峰，提示脂褐素存在，而在蛋白尿期和幼年期组织中未观察到该成分。这些观察结果表明，基于AF的方法可能为肾组织生化变化提供有价值的见解。虽然结果为初步性质，但扩大样本量的进一步研究有助于完善这些发现并探索其在肾脏疾病表征和诊断中的相关性。
