《Nature Communications》：Comparative analysis of Cdc48-dependent proteolysis at the ER, mitochondria and chloroplasts
泛素-蛋白酶体系统（UPS)是真核生物中首要的蛋白质水解系统。虽然可溶性核质蛋白可被UPS直接接近，但定位于细胞器内的蛋白质面临与膜相关的主要可及性挑战。细胞通过利用保守的AAA+ ATP酶Cdc48将细胞器蛋白提取至细胞质，从而实现蛋白酶体降解，来克服这一问题。主要的Cdc48依赖性蛋白质降解系统存在于内质网(ER)、线粒体和叶绿体中，并经过独特调控以分别在相应细胞器内实现蛋白质稳态。研究人员提供对这些系统的聚焦比较，分析它们之间的相似性和差异。对基本原理的深入理解对人类健康和农业具有重要启示意义。
## 引言
蛋白质稳态（蛋白质平衡)是活细胞功能的重要方面，用于精细调节和平衡蛋白质合成、折叠与降解。在真核生物中，后者主要由泛素-蛋白酶体系统(UPS)协调，这是一个从酵母到光合生物(包括植物)和哺乳动物高度保守的核质途径。在该系统中， destined for degradation的蛋白质被标记(共价标记)一种称为泛素的小分子76个氨基酸的多肽。泛素附着称为泛素化(或泛素修饰)，由一系列酶级联催化完成。首先，泛素在ATP依赖性反应中由泛素激活酶(E1)激活，形成泛素-E1硫酯键。激活的泛素随后转移至泛素结合酶(E2)，形成另一个硫酯。最后，泛素被转移至目标蛋白(或底物)，由泛素连接酶(E3)提供底物特异性。从E2到泛素到底物的转移可以直接发生，也可以通过E3作为中间体进行。泛素附着主要发生在赖氨酸残基上，导致底物单泛素化或更常见的多泛素化。在多泛素化中，每个泛素单元通常连接至前一个泛素单元的几个赖氨酸之一，形成直链或支链多泛素链。由于底物特异性由E3赋予(从而只有目标蛋白被标记降解)，人类中有超过600种E3连接酶，植物(拟南芥)中有超过1400种E3连接酶，而每种情况下仅存在少数E1和E2。随后，泛素标记的蛋白质进入并被称为26S蛋白酶体的大型多亚基蛋白水解机器降解，泛素分子通过去泛素化酶(DUBs)的作用释放以供后续再利用。
尽管可溶性核质蛋白可被26S蛋白酶体轻易接近，但多聚蛋白复合物、整合膜蛋白和定位于细胞器的蛋白质需要额外的能量依赖性提取或逆易位步骤才能被降解。这一物理提取过程由称为Cdc48的AAA+ ATP酶的蛋白质解折叠酶活性协调。活性Cdc48马达复合物是同六聚体环，每个Cdc48单体具有N端、双ATP酶和C端尾结构域。该复合物与几种辅助因子协同工作，这些辅助因子有助于底物识别和解折叠。Cdc48催化的提取步骤对于暴露不可接近的蛋白质并使其可用于26S蛋白酶体降解至关重要。
内质网(ER)、线粒体和光合真核生物中的叶绿体已经获得了不同的泛素介导的蛋白质降解系统，这些系统专门适应各自细胞器的不同需求。研究最充分的系统是1990年代首次发现并此后被广泛研究的内质网相关蛋白质降解(ERAD)。更近期，线粒体相关蛋白质降解(MAD)、线粒体蛋白质易位相关降解(mitoTAD)和叶绿体相关蛋白质降解(CHLORAD)被确定为分别维持线粒体和叶绿体内蛋白质稳态的关键过程。尽管本文未详细讨论，但在脂滴(LDAD)和内核膜(INMAD)中也发现了类似系统。这些UPS依赖性途径都围绕Cdc48在底物蛋白逆易位中的关键作用展开，但针对相关细胞器提出的独特挑战进行了专门化，同时也为整体细胞蛋白质稳态做出贡献。
## 26S蛋白酶体
26S蛋白酶体是一个2.5 MDa的多蛋白复合物，是UPS途径末端的核质ATP依赖性蛋白酶。它在真核生物中高度保守，由两个功能不同的稳定亚复合物组成：20S核心颗粒(CP)和19S调节颗粒(RP)，后者以一个或两个拷贝外周结合核心。20S CP由四个堆叠的异七聚体环组成(两个外侧α环包含α1-α7亚基，两个内侧β环包含β1-β7亚基)，形成桶状结构。组装后，中心的两个β环形成具有六个催化位点的催化腔，负责切割底物蛋白中的肽键。进入这一蛋白水解腔的通道由β环两侧的α环形成的顶端门严格控制。在没有19S颗粒的情况下，α环门保持关闭，防止蛋白质非受控进入腔室。
19S RP是底物识别、去泛素化、解折叠和转位进入20S核心所必需的。它由两个不同的亚复合物组成：靠近CP α环的基座亚复合物，和马蹄形盖亚复合物。基座亚复合物包含六个调节颗粒AAA+ ATP酶亚基(Rpt1-Rpt6)和四个调节颗粒非ATP酶亚基(Rpn1, Rpn2, Rpn10, Rpn13)。ATP酶亚基形成六聚体环，利用ATP水解的能量解折叠底物蛋白并通过轴向孔转位进入20S核心；而非ATP酶亚基发挥泛素识别和结合功能。最外侧的盖复合物由九个非ATP亚基(Rpn3, Rpn5-Rpn9, Rpn11, Rpn12, Rpn15)组成，帮助连接19S颗粒与核心，其中DUB Rpn11参与泛素回收。
蛋白水解始于泛素化底物与19S RP泛素受体Rpn亚基的高亲和力结合，导致相邻CP α环的构象变化和开放门控轴向孔。随后Rpt环结合底物蛋白的非结构化区域，利用ATP水解机械地解折叠底物。随着底物被解折叠，它被穿线通过开放的α环孔进入20S CP的蛋白水解腔。在此过程中，Rpn11从底物上切割泛素链，确保只有底物而非泛素被内化。在腔内，底物遇到具有蛋白水解活性的β亚基，将底物切割成短肽，这些短肽随后释放到细胞质中，并被各种肽酶进一步降解为氨基酸。
## 六聚体AAA+ ATP酶Cdc48
Cdc48(哺乳动物中为p97/VCP)蛋白是一种高度保守且必需的分子伴侣，是AAA+(与多种细胞活动相关的ATP酶)家族ATP酶的成员——类似于19S RP的Rpt亚基。Cdc48蛋白在多种细胞过程中发挥重要作用，特别是与蛋白质稳态相关的过程。它利用其ATP酶驱动的解折叠酶活性，从大分子复合物和膜区室(如被ERAD、MAD、mitoTAD和CHLORAD途径靶向的细胞器)中提取、解聚和解折叠泛素化底物，使其能够在细胞质中被26S蛋白酶体降解。
Cdc48的运作结构是同六聚体环复合物。每个亚基具有N端结构域(NTD)和两个保守的AAA+ ATP酶结构域(D1和D2)串联堆叠，在六聚体中，后者形成两个ATP酶环，中央轴向孔对于底物转位和解折叠至关重要。ATP酶结构域包含Walker A和Walker B基序，分别介导ATP结合和水解。ATP的水解在六聚体周围以顺序、协调的方式发生，D1环主要参与底物结合和初始转位步骤，D2环提供驱动底物解折叠的主要机械力。ATP酶结构域的协调运动被认为通过"螺旋楼梯"机制介导底物穿线通过中央孔。螺旋楼梯由ATP酶结构域的多个孔环形成，其中包含保守的芳香族残基。这些残基以阶梯方式抓取和拉动底物多肽，由ATP依赖性构象循环驱动，将底物转位通过中央孔。孔环还充当分子棘轮以防止底物倒退，从而确保单向转位。在复合物的外周是NTD，它们具有柔性并介导与多种辅助因子和底物的相互作用。NTD采取多种构象以适应不同的辅助因子，在ATP酶循环期间经常相对于ATP酶环发生旋转或位置偏移，从而协调底物招募与处理。Cdc48蛋白还具有约50个氨基酸的保守C端延伸(或尾)，有助于调节ATP酶活性并作为一部分辅助因子的结合位点。
Cdc48的广泛多功能性很大程度上归因于其与多种辅助因子的相互作用。迄今为止已鉴定出大量辅助因子，它们通过将Cdc48导向不同底物、亚细胞位置或生物过程来赋予特异性。这些辅助因子可分为三个功能组：底物招募因子，结合泛素化底物并促进其递送至Cdc48；底物处理因子，协助底物的重塑和解折叠；以及调节辅助因子，调节Cdc48的ATP酶活性。大多数辅助因子与Cdc48的NTD相互作用，尽管少数已被证明与C端尾相互作用。
## 内质网蛋白质降解途径
内质网(ER)是一个多功能细胞器，是分泌蛋白生物合成的主要入口。内质网中的蛋白质稳态对于协调多种功能至关重要，这依赖于ERAD，ERAD选择性地将错误折叠或未组装的蛋白质靶向26S蛋白酶体降解。ERAD缺陷导致错误折叠蛋白积累，引起细胞损伤。因此，ERAD与多种疾病相关并不奇怪，包括神经退行性疾病如帕金森病，其中缺陷蛋白的清除受损导致神经元功能破坏。
最初两项关键发现揭示了内质网蛋白质降解与UPS之间的联系：酵母中的遗传研究揭示了E2酶在ER易位子组分Sec61p突变体周转中的参与；哺乳动物细胞中的抑制剂研究揭示了突变型、ER错位囊性纤维化跨膜传导调节因子(ΔF508 CFTR)的降解是UPS依赖性的。后续发现表明ERAD在真核生物中保守，并可根据底物位置或其错误折叠结构域的位置分为不同分支。在酵母中，研究最多的途径是ERAD-L(腔)、ERAD-M(膜)和ERAD-C(细胞质)。研究还提供了对更专门化ERAD途径的见解，包括核糖体相关ERAD(ERAD-RA)和易位子相关ERAD(ERAD-T)。
### 内质网腔内错误折叠结构域蛋白质的降解(ERAD-L)
ERAD的靶标在细胞器表面由不同E3连接酶与几种E2泛素结合酶(如Ubc7)协同作用进行泛素化。后者被Cdc48/Ufd1相互作用元件1(Cue1)招募至内质网并激活，导致形成赖氨酸48(K48)连接的多泛素链作为靶标降解信号。在ERAD-L中，底物主要被RING型E3泛素连接酶羟甲基戊二酰辅酶A还原酶降解蛋白1(Hrd1)结合，后者还具有作为转位酶的多跨膜结构域。
Hrd1在复合物中形成，其中至少两个专门的底物识别因子确保仅终末错误折叠蛋白的选择性降解：酵母OS-9同源物Yos9，是一种特异性识别ER糖蛋白上甘露糖修剪N-聚糖的凝集素蛋白(长期ER滞留和折叠失败的标志)；以及Hrd3(哺乳动物中为SEL1L)，在Hrd1复合物中充当支架，支持复合物稳定性，并结合靶多肽的非结构化或错误折叠区域。N-聚糖信号由糖苷酶的持续作用(特别是逐步甘露糖酶切割)产生，最终暴露聚糖核心相邻的α1,6-连接甘露糖，这是Yos9(哺乳动物中为OS-9)识别的先决条件。这与多肽的未折叠性质一起将底物靶向Hrd1复合物；因此在ERAD中存在底物选择的双重信号(基于聚糖和基于多肽构象)。
近期研究表明，ERAD的启动涉及由甘露糖酶样蛋白1(Mnl1；也称为Htm1)和蛋白质二硫键异构酶(Pdi1)组成的腔内双功能复合物。Mnl1-Pdi1复合物修剪底物聚糖链，如前所述，并可能还原二硫键以生成可跨ER膜转运的未折叠多肽。此外，几种腔内伴侣蛋白，包括热休克蛋白70(Hsp70)型因子Kar2，发挥维持底物溶解度和促进ERAD选择的作用。
底物的逆易位由Hrd1与菱形假蛋白酶降解于ER 1(Der1)合作介导，U1-Snp1相关因子1(Usa1)在此逆易位子复合物中发挥支架功能。使用冷冻电镜的结构分析揭示了ERAD-L中功能单体Hrd1复合物的结构和机制细节。在该研究中，通过分析两个亚复合物(Hrd1-Usa1-Der1-Hrd3和Hrd1-Hrd3-Yos9)，基于重叠的蛋白质组成组装了整个Hrd1复合物的模型。在复合物中，Hrd3和Yos9相互创建腔内结合位点，检测底物蛋白的异常折叠和聚糖修饰。识别后，底物被递送至Hrd1逆易位子。在该复合物的这一部分，Hrd1形成具有朝向细胞质腔的"半通道"，Der1形成具有朝向腔内腔的另一"半通道"，两者在变薄、扭曲的膜区域并置。Hrd1和Der1的侧门相互面对，允许底物从腔内到达细胞质。这一逆易位过程由底物多肽环插入ER膜启动，环的一个区段接触Hrd1，另一个区段接触Der1。
### 内质网膜内错误折叠结构域蛋白质的降解(ERAD-M)
在ERAD-M中，膜嵌入区域有缺陷的整合膜蛋白被靶向降解。ERAD-L机制的核心组分也参与该途径，包括Hrd1、Hrd3和可能的Usa1，但不包括腔内识别组分和Der1。Der1可能被Der1样家族成员(Dfm1)取代，后者在底物逆易位和Cdc48招募中发挥作用。关于ERAD-M中底物识别的了解远少得多。有研究表明Hsp70和Hsp40等伴侣蛋白可能有助于维持底物的溶解度。
另一种侧重于膜的现象涉及清除和降解阻塞ER易位子(Sec61)的蛋白质，称为ERAD-T。无法完全易位并停滞在Sec61中的蛋白质通过暴露非结构化区域被识别。这些底物随后也被Hrd1靶向，但相关途径定义尚不充分。这在功能上类似于线粒体中的mitoTAD过程。
### 内质网细胞质侧错误折叠结构域蛋白质的降解(ERAD-C)
在ERAD-C中，细胞质结构域有缺陷的蛋白质被靶向降解。该分支由另一种E3连接酶降解α-2 10(Doa10)定义。Doa10蛋白最初因其在降解可溶性转录因子(Matα2)以及ER蛋白中的作用而被鉴定，揭示其降解可溶性和膜锚定底物的能力。因此，它定位于内核膜和ER。与Hrd1类似，Doa10是一种具有朝向细胞质RING结构域的大型多跨膜蛋白，被认为在底物逆易位中发挥作用。
冷冻电镜结构分析揭示了Doa10的非寻常结构。其中，跨膜结构域形成C形(或马蹄形)结构，具有被膜脂质占据的大型中央腔，而保守的中间结构域形成朝向细胞质开放的侧向隧道。尽管细胞质RING结构域的分辨率较低，但它位于马蹄形结构的顶端，与侧向隧道相对。这种排列(侧向开口、中央腔、RING)可能在degron进入侧向隧道后为选择性底物结合提供最佳对接平台，确保只有底物才能进入中央腔被RING结构域泛素化。有研究表明，底物的degron肽段(例如暴露的疏水损伤)进入侧向开口对于多泛素化至关重要。
Doa10与E2酶Ubc6(膜整合的)和Ubc7(细胞质的，功能上依赖于Cue1)协同工作，形成K48连接的多泛素链，发出降解信号。ERAD-C中的底物识别了解尚不充分，但也涉及细胞质Hsp70/Hsp40伴侣蛋白结合错误折叠的底物结构域，帮助维持底物处于可溶的、有降解能力的状态。近期发现表明，Doa10侧向隧道形成膜嵌入进入路径，直接结合底物暴露的疏水区段，从而实现脂双层内的选择性识别。
### 不同ERAD途径在Cdc48处的汇聚
泛素化后，各种ERAD分支在Cdc48处汇聚，Cdc48介导底物逆易位的能量需求步骤，然后于蛋白酶体中降解。Cdc48蛋白与其辅助因子泛素融合降解1(Ufd1)和核蛋白定位4(Npl4)协同工作(该复合物称为Cdc48-UN)。Ufd1和Npl4辅助因子支持Cdc48的底物识别和解折叠，对于降解前的底物处理至关重要。Cdc48-UN复合物由UBX结构域含蛋白2(Ubx2)招募至ER，Ubx2将其泛素相关(UBA)和泛素调节X(UBX)结构域朝向细胞质暴露。UBX结构域为细胞质Cdc48提供对接位点，而UBA结构域促进与泛素化底物蛋白的相互作用。在最后阶段，DUB酶修剪泛素链，处理后的底物被转移至蛋白酶体进行降解。至少对于ERAD-L，已显示底物由卵巢肿瘤1(Otu1)和一种或多种其他DUB处理。
### 植物中的ERAD
虽然ERAD途径及其基本机制在酵母和哺乳动物系统中研究充分，但植物中的ERAD了解相对有限。尽管ERAD的核心装置保存良好，植物显著拥有扩展的E3连接酶库、多个核心ERAD组分的异构体，以及一些CDC48-UN复合物的适应性变化，表明光合真核生物中的复杂性增加。植物还拥有扩展的UBX型Cdc48接头蛋白组，称为植物UBX结构域含蛋白(PUX)，表明Cdc48依赖性过程在植物中大量多样化。这些进化适应可能与植物的固着生活方式相关，使植物能够更好地管理多样化的环境挑战。
全基因组分析揭示，模式植物拟南芥将近6%的蛋白质组(~1600个基因)投入UPS，其中大多数组分是泛素连接酶(>1400个基因)，使植物中蛋白水解调控具有非凡的特异性和复杂性。尽管其中一些E3具有明显的酵母和动物对应物，但许多可能是植物特有的，从而提供植物独特的调控。与此更广泛图景一致，几种与ERAD相关的植物特异性E3连接酶已被鉴定。例如，拟南芥中鉴定的细胞质ERAD介导RING指蛋白(EMR)影响ER应激条件下的油菜素内酯激素信号；而天蓝苜蓿中鉴定的ER膜定位盐差向霉素诱导RING指蛋白(STMIR)在盐胁迫期间缓解ER应激。这两个E3都与E2结合酶UBC32协同工作，但机制细节尚待确立。
拟南芥核心ERAD组分Hrd1、Hrd3、Yos9和Ubc6的一个或多个同源物(分别称为Hrd1a和Hrd1b、Hrd3a[也称为EMS突变bri1抑制子5, EBS5]、OS-9[也称为EBS6]和UBC32)已被鉴定和研究。这些组分在错误折叠ER蛋白的降解中发挥关键作用，包括两种ER滞留的油菜素内酯受体突变体(BRI1)。标记错误折叠糖蛋白以进行降解的N-聚糖信号与酵母和动物中的类似。拟南芥中Der1的多种异构体也存在(Der1、Der2.1和Der2.2)，但缺乏Cue1和Usa1同源物。然而，植物中Der1与Hrd1相互作用的生化证据缺失；这可能与植物中缺乏Usa1有关，Usa1在酵母中稳定Der1-Hrd1关联。有趣的是，几种植物特异性Hrd1相互作用已被鉴定。EBS7蛋白在植物中高度保守，定位于ER膜，帮助维持Hrd1的稳定性。这种EBS7的稳定功能由两个与Hrd1相关的密切相关蛋白(PAWH1和PAWH2)支持，它们在植物中同样高度保守。尽管存在这些植物特异性因子，核心ERAD复合物(包含Hrd1a、Hrd3a/EBS5和OS-9/EBS6)在植物中似乎保存良好，因为结构预测显示其与酵母中的折叠模式高度相似。然而，尝试将EBS7和PAWH1纳入该结构模型时得分较低。
水稻中的近期观察揭示了信号肽酶(SPP)样蛋白与ERAD之间的密切关联。这些是介导膜内蛋白切割过程的天冬氨酰蛋白酶，新发现与哺乳动物中的早期观察平行。水稻蛋白与植物耐热性相关，使它们成为作物改良的有前景靶标。
尽管Cdc48在植物中高度保守，但它确实显示出一些植物特异性适应。在拟南芥中，有五个Cdc48同源物(A至E，其中Cdc48A显然发挥主要作用)，两个Npl4同源物和三个Ufd1同源物，再次表明复杂性增加。近期工作揭示Cdc48A表现出独特的结构域动力学，并以独特方式结合Npl4。与酵母系统不同，植物Npl4和Ufd1不形成强制性异二聚体；相反，Npl4可以独立地与Cdc48A结合以介导靶标降解，尽管辅助因子的联合作用是互补的。
## 线粒体蛋白质降解途径
线粒体是真核细胞中必需的能量供应者。它们通过古老的内共生事件起源于α-变形菌，因此被双层膜系统包围。它们的形成和关键代谢活动的传递需要约1000-1500种核编码蛋白质，这些蛋白质在细胞质核糖体合成后翻译后输入，以及少量细胞器编码蛋白质。线粒体外膜易位子(TOM)是蛋白质输入途径入口的多蛋白复合物。由于线粒体在细胞呼吸和代谢中的核心作用，这些细胞器中的蛋白质异常会严重损害细胞功能并产生严重后果，与多种人类病理相关。
泛素依赖性蛋白质降解通过去除受损或错误折叠的蛋白质，以及TOM复合物处易位停滞的前体蛋白，帮助维持线粒体质量，防止其积累和潜在毒性。这种蛋白质水解还通过控制融合和分裂因子的水平在调节线粒体动力学中发挥作用。因此，理解这些系统的细微之处不仅对基础研究至关重要，而且对其提供治疗干预的潜力也至关重要。
线粒体表现出两种Cdc48依赖性途径，能够清除错误折叠或异常蛋白质，以及许多其他不依赖Cdc48的途径。两种相关途径是线粒体相关蛋白质降解(MAD)和线粒体蛋白质易位相关降解(mitoTAD)。前者通过降解错误折叠或受损蛋白质(特别是线粒体外膜(OMM)中的蛋白质)来维持线粒体蛋白质稳态，而后者清除捕获在TOM易位子输入通道中的前体蛋白。
### 线粒体相关蛋白质降解(MAD)
早期工作确定MAD是一种应激反应性的、Cdc48/p97依赖性途径，介导线粒体外膜蛋白的周转。多种泛素连接酶已被报道在MAD中发挥作用，其作用尤其与线粒体动力学相关。例如，定位于OMM的发动蛋白GTP酶fuzzy onion 1(Fzo1)控制线粒体融合，由逆转SPT表型蛋白5(Rsp5，一种HECT型E3连接酶)和线粒体分布与形态蛋白30(Mdm30，一种SCF型E3连接酶的F-box蛋白)协同泛素化。Fzo1的泛素化受到严格控制，可由DUB泛素特异性蛋白酶2和12(Ubp2、Ubp12)逆转。此外，线粒体相关F-box蛋白-1(Mfb1)也被认为参与重塑Fzo1以维持其 competent状态。其他OMM蛋白(包括蛋白质输入受体Tom70、Msp1和Mdm34)也被Rsp5靶向，尽管这可能独立于Mdm30发生。MAD中涉及的其他E3连接酶包括RING结构域蛋白Ubr1和sir拮抗剂1(San1)。
与ERAD显著相似，Ubx2在将Cdc48-UN复合物招募至OMM中发挥作用。虽然VCP/Cdc48相关线粒体应激反应性1(Vms1)蛋白也被认为在Cdc48招募中发挥作用，但近期证据表明它参与核糖体质量控制。另一个被认为参与MAD底物Cdc48招募的组分是Doa1(也称为Ufd3)。Doa1已被证明结合Cdc48 C端，但它如何影响线粒体蛋白的降解尚未完全理解。与ERAD进一步相似，细胞质Hsp70/Hsp40伴侣蛋白参与其中，大概维持线粒体底物处于适合泛素化和Cdc48依赖性提取的非聚集状态。虽然已确定底物通过Cdc48提取，但潜在机制长期不清楚，包括底物是从膜上直接移除还是通过逆易位子。然而，近期工作支持蛋白质输入机制的核心通道组分(即Tom40蛋白)在MAD逆易位功能中的作用。
除降解OMM底物外，MAD系统还可能作用于细胞器内部的蛋白质。例如，膜间隙的蛋白质通过TOM机制释放以进行蛋白酶体降解，尽管Cdc48是否参与该途径尚不清楚。此外，多项研究表明UPS可能调控内膜或基质蛋白。例如，MAD被提出通过靶向哺乳动物细胞中的线粒体内膜来调控能量代谢，特别是琥珀酸脱氢酶A亚基(SDHA)蛋白。另一项研究鉴定酵母中的基质蛋白为MAD底物，泛素化优先发生在氧化应激条件下，MAD活性在此类情况下对细胞适应性至关重要。更近期的研究呈现了酵母线粒体基质中存在泛素化酶的证据，特定E2酶的操纵导致线粒体蛋白泛素化的变化。靶标蛋白可能以Cdc48依赖性方式从线粒体内部输出(或逆易位)的证据也有报道。
虽然MAD已在酵母中得到充分表征，但关于等效植物系统的知识仍然有限。近期，拟南芥中鉴定的一种新型细胞质蛋白——尾锚定外膜蛋白跨膜结构域结合蛋白(TTOP)——被假设与Cdc48合作，以泛素依赖性方式去除线粒体TOM复合物(以及叶绿体中等效易位子复合物)的尾锚定受体组分，促进其递送至蛋白酶体。TTOP蛋白具有N端泛素样(UBL)结构域，可能介导蛋白酶体对接。
### 线粒体蛋白质易位相关降解(mitoTAD)
TOM易位子的活性状态对线粒体生物发生和呼吸至关重要，但如果转位通道被捕获的前体蛋白阻塞，则可能丧失。这种阻塞可进一步诱导未导入前体蛋白的积累，导致细胞质蛋白质稳态应激，对细胞高度有毒。mitoTAD途径提供了一种持续的监视机制，清除易位停滞的前体蛋白以避免此类破坏性情景。
与MAD途径一样，Rsp5提供E3连接酶活性，在这种情况下通过锚定在TOM易位子的Tom70受体上。其他E3连接酶是否参与，以及相关E2酶的身份，仍是未解问题。同样，之前在ERAD中鉴定为关键参与者的Ubx2组分参与其中。Ubx2的一个线粒体亚群在通过Tom70受体插入OMM后特异性结合TOM复合物。Ubx2蛋白招募Cdc48及其Ufd1-Npl4辅助因子复合物至TOM复合物，与其在ERAD途径中的作用平行。这样被招募后，Cdc48马达通过从转位子通道中提取捕获的前体蛋白，促进其蛋白酶体降解。有问题的前体蛋白如何被识别以进行泛素化尚不清楚，尽管这可能取决于前体在TOM复合物停留的时间。DUB Ubp16也与TOM复合物相关，可能通过从缓慢导入但正常的前体蛋白上移除不适当的泛素标记来抵消Rsp5的作用。
在一条平行的、Cdc48非依赖性途径中，TOM复合物处停滞的泛素化前体蛋白通过Pth2-Dsk2系统递送至蛋白酶体。肽基-tRNA水解酶2(Pth2)在TOM复合物处提供膜嵌入对接位点以招募显性抑制Kar1 2(Dsk2)，Dsk2是一种介导底物向蛋白酶体转移的UBA结构域蛋白。此外，虽然mitoTAD途径似乎在正常条件下运作，但在应激条件下额外的清除系统发挥作用。线粒体受损蛋白输入反应(mitoCPR)系统也运作以从TOM复合物去除易位停滞的前蛋白，但它以Cdc48非依赖性方式运作，使用不同的AAA+ ATP酶Msp1作为马达。线粒体蛋白输入异常诱导citrinin敏感敲除蛋白1(Cis1)的表达，Cis1将Msp1连接至Tom70以促进停滞前蛋白的提取。
有趣的是，线粒体和ER合作以清除OMM上的错误靶向尾锚定蛋白。Msp1在此过程中发挥关键作用，通过识别和去除这些错误定位的尾锚定蛋白。一旦被Msp1在OMM上识别，底物在内质网-线粒体接触位点由ERAD E3连接酶Doa10泛素化。泛素化后，底物由Cdc48从膜中提取并递送至蛋白酶体降解。
## 叶绿体蛋白质降解途径
叶绿体是植物和藻类的特征性细胞器。它们配备有光合作用分子机器，这是将二氧化碳固定为有机分子并释放分子氧的关键过程。与线粒体类似，叶绿体起源于原核生物内共生，尽管在这种情况下内共生体是蓝细菌。反映其相似的起源，叶绿体与线粒体共享几个特征，包括双层包膜膜和这些膜中蛋白质输入系统的需求。蛋白质输入机制由外膜和内叶绿体膜易位子(TOC和TIC)组成。数千种核编码蛋白质通过TOC-TIC系统易位，以在细胞器的不同亚区室中构建必需的分子系统。值得注意的是，定位于外被膜(OEM)的TOC系统直接受细胞质UPS调控，能够响应内部和外部线索对蛋白质输入进行集中控制。这种叶绿体相关蛋白质降解(CHLORAD)系统使用遗传学和蛋白质组学在拟南芥中鉴定，但在植物中广泛保守。
体内分析揭示CHLORAD在植物生长和发育中发挥重要作用。通过施加对蛋白质输入的控制，该系统帮助塑造细胞器蛋白质组和功能，这在发育转变期间(如果实成熟)尤为重要。值得注意的是，该系统帮助在不利环境条件下通过控制光合作用来限制有害活性氧(ROS)的形成，从而对应激耐受性做出积极贡献。这些观察表明CHLORAD作为作物改良技术具有相当大的潜力。
### 叶绿体蛋白质输入机制的泛素依赖性降解
CHLORAD系统的关键组分是质体蛋白质输入抑制因子1座点1(SP1)和SP2，两者都是整合OEM蛋白。前者是一种RING型E3连接酶，泛素化TOC蛋白。它有两个跨膜区段、一个直接与其TOC靶标相互作用的膜间隙结构域，以及一个朝向细胞质的C端RING结构域。与ERAD中涉及的E3连接酶(如Hrd1)不同，SP1缺乏同时形成逆易位子的能力。相反，与Omp85相关的β桶通道蛋白SP2被认为满足TOC蛋白提取的逆易位子需求。SP1的两个同源物SP1样1(SPL1)和SP2帮助微调CHLORAD活性，SPL2与SP1具有部分功能冗余，SPL1作为SP1的负调控因子发挥作用。CHLORAD中涉及的E1和E2酶的身份目前尚不清楚。
Cdc48在该途径中的参与反映了TOC组分是需要提取的膜锚定蛋白这一事实。其作用通过Cdc48与已建立的CHLORAD系统组分和靶标的相互作用，以及植物中Cdc48抑制时TOC积累升高而被揭示。植物中存在多种Cdc48接头蛋白，近期工作揭示了其中之一在CHLORAD中的重要作用。植物UBX结构域含蛋白10(PUX10)定位于叶绿体OEM，在那里它介导Cdc48招募至叶绿体表面以及泛素化底物向Cdc48的递送。这呈现了与Ubx2在内质网和线粒体中作用的显著相似性，事实上PUX10是Ubx2的同源物。这两个蛋白确实具有显著的序列和拓扑相似性，都具有朝向细胞质的UBX和UBA结构域，分别结合Cdc48和泛素化底物蛋白。
### 其他叶绿体蛋白的泛素依赖性降解
有趣的是，Cdc48接头蛋白Ufd1和Npl4的同源物在拟南芥中也存在，尽管它们是否类似地参与CHLORAD依赖性输入机制降解尚待确定。然而，在这些接头蛋白的突变体中观察到叶绿体蛋白(包括基质和类囊体中的光合作用机制组分)的稳定化出乎意料，指向Cdc48和UPS在叶绿体蛋白降解中的更广泛作用。这一结论得到使用蛋白质组学和免疫学方法在叶绿体内部检测到泛素化蛋白的独立检测的支持，以及SP2和Cdc48缺陷植物中光合作用蛋白降解受损的支持。虽然其中一些发现已证明存在争议，但它们确实提出了关于泛素化如何与细胞器蛋白质稳态相关的重要而有趣的问题，涉及泛素化位点、相关泛素化机制的身份和定位，以及可能使泛素化细胞器靶标递送至细胞质以进行蛋白酶体降解的机制。与前面讨论的相应线粒体结果一样，进一步的研究对于阐明这些观察的意义并揭示潜在机制是必要的。
## 不同系统的比较
上述不同细胞器特异性蛋白质降解途径共享许多相似之处，其中最显著的是它们都包含泛素化酶级联，并围绕Cdc48逆易位马达将靶蛋白递送至26S蛋白酶体降解。然而，也存在几个途径显示出显著差异的领域，例如相关底物、E3连接酶、逆易位子和Cdc48接头蛋白或招募因子的身份和性质。
### Cdc48依赖性蛋白质降解途径的进化视角
古菌，包括作为真核生物最近原核生物近亲的Asgard古菌，拥有Cdc48和20S蛋白水解颗粒，以及真核生物泛素化级联的原始前体。此外，已显示一些古菌拥有由20S核心颗粒与Cdc48组成的蛋白水解系统，后者被认为类似于真核生物蛋白酶体中19S颗粒的AAA+亚基发挥作用。因此，可以推断在真核生物发生期间——随着泛素化系统的精细化和19S颗粒的伴随出现，以及内质膜系统和细胞器形成相关的细胞复杂性增加——Cdc48被重新利用以履行蛋白酶体作用前的上游功能，包括从膜中提取靶蛋白。
真核生物中复杂内部区室化的出现在蛋白质稳态方面提出了新挑战，而Cdc48非常适合解决这些挑战，其日益多样化的功能得到了大量不同辅助蛋白的支持。ERAD很可能随着ER本身一起进化，之处细胞器在分泌途径中的核心作用。虽然线粒体进化的时机一直存在争议，但近期证据支持这发生在相对较晚的时期(内膜系统出现之后)，表明MAD可能已经适应了ERAD中已建立的系统和组分(如Cdc48和Ubx2)。
光合真核生物后期获得第二个高度蛋白质性的内共生细胞器——叶绿体，对细胞蛋白质稳态提出了额外需求。这需要另一种专用UPS途径CHLORAD的进化来调控新细胞器，同样这似乎也采用了其他途径的组分(特别是Cdc48和PUX10/Ubx2)。然而，多种CDC48依赖性途径的共存为植物引入了与底物特异性和调控协调相关的独特挑战，为细胞蛋白质稳态网络增加了进一步复杂性。为满足这些需求，可能发生了两种进化适应：预先存在的系统(包括ERAD和MAD)可能在植物中经历了功能专门化或多样化，以增强靶标选择特异性并区分不同细胞器；CHLORAD途径发展了量身定制的机制以满足叶绿体的独特需求。
### E3连接酶和通道功能以不同方式提供
鉴于E3连接酶赋予底物特异性，这些组分构成三个焦点途径之间分化的主要领域并不奇怪。每个系统都有其自身独特的E3连接酶组，使其能够有选择地作用于相关细胞器或细胞器亚区室中定义的一组靶标，并在适当条件下发挥作用。ERAD E3连接酶Hrd1和Doa10的一个显著特征是其多功能性：由于其膜嵌入区段是多拓扑性的(分别包含8和14个跨膜区段)，它们还具有促进逆易位子形成或膜内底物结合的能力。相比之下，迄今为止在MAD、mitoTAD和CHLORAD中鉴定的E3连接酶(如Rsp5、Mdm30和SP1)往往具有更简单的拓扑结构或是细胞质的，因此缺乏形成深膜腔以进行底物输出或结合的能力。在CHLORAD的情况下，这种情况可能导致SP2作为单独的专用通道组分的招募。SP2蛋白是Omp85超家族的16链β桶蛋白，因此与细菌中的各种其他蛋白质转位因子相关。将具有如此明显原核生物起源的因子招募到本质上是真核生物特征的系统中是相当引人注目的。相比之下，ERAD中涉及的通道形成组分由α-螺旋跨膜区段形成。
在内质网和叶绿体中，蛋白质输入(用于新蛋白质生物合成)和蛋白质输出(用于通过ERAD和CHLORAD进行蛋白水解)通过不同途径发生：蛋白质输入分别采用Sec61和Toc75易位子，而蛋白质输出分别通过上述Hrd1和SP2组分介导。在线粒体中，情况相当不同，因为MAD系统似乎使用相同的通道蛋白执行输入和输出功能。相关组分是Tom40，它作为TOM复合物的核心通道形成组分而广为人知。这反映了MAD与其他系统之间的根本差异，还是Tom40蛋白使其能够更灵活发挥功能的特殊特征，尚不清楚。无论如何，有趣的是注意到Tom40在结构类似于SP2，因为它也是一种β桶蛋白，尽管与SP2不同，它不是Omp85超家族的成员。这表明β桶蛋白可能非常适合这些细胞器中的逆易位功能。即使CHLORAD的输入和输出通道组分是不同的蛋白质(即Toc75和SP2)，值得注意的是它们仍然是相关的，因为它们都属于Omp85超家族。
### Cdc48招募至细胞器表面涉及相似因子
本文描述的不同系统依赖于Cdc48施加的拉力来提取靶蛋白，然后由26S蛋白酶体降解。值得注意的是，Cdc48被招募至各细胞器表面的方式呈现出一些有趣的共性和差异。Ubx2蛋白在ERAD、MAD和mitoTAD中的Cdc48招募中发挥作用。尽管如此，Doa1也被报道在MAD中促进这一功能，表明该系统中Cdc48的招募有额外需求或控制系统。虽然PUX10蛋白在CHLORAD途径中履行类似作用，但应注意到PUX10与Ubx2密切相关(具有朝向细胞质的UBX和UBA结构域)，并且可能以非常相似的方式发挥作用。
关于Cdc48处的底物识别和处理，Ufd1和Npl4接头蛋白似乎参与大多数讨论的系统，但在植物中经历了显著多样化。尽管这些接头蛋白尚未与叶绿体蛋白质输入的调控相关联，但相应的突变体已被证明影响内部定位叶绿体蛋白的丰度。
### 系统面临不同的拓扑挑战
另一个显著的分化领域与系统面临的不同拓扑挑战有关，这源于ER仅由单层膜形成，而内共生来源的细胞器都被双层包膜包围这一事实。尽管ER在这方面相对简单，ERAD仍然非常复杂，具有在膜两侧和膜内运作的专用途径(即ERAD-L、-C和-M)。在前者中，靶蛋白在泛素化之前被移位至ER表面。虽然MAD和CHLORAD迄今已被证明主要针对外膜蛋白，但越来越多的证据表明这些或相关系统可能另外处理位于内部的蛋白质，在膜间隙、内膜或更远的位置，尽管潜在的分子机制了解甚少。事实上，除ERAD-L外，所有情况下靶标选择和控制通向逆易位子的初始事件都 poorly characterised。后者系统利用Yos9、Hrd3和Mnl1-Pdi1等内部蛋白确保适当的底物招募和处理输出。
### 与细胞器特异性蛋白质输入途径的联系普遍存在
最后，值得注意的是，本文讨论的所有系统都与相关细胞器的主要蛋白质转位或输入系统显示出密切联系。ER和线粒体都采用基于Cdc48的系统从易位子通道(Sec61和Tom40，分别)清除捕获的前体蛋白，从而防止蛋白质转位装置的永久性损伤以及更广泛的蛋白质稳态相关细胞毒性——这些分别是ERAD-T和mitoTAD系统。线粒体蛋白质输入的翻译后性质可能使易位子堵塞成为该细胞器特别严重的问题。此外，在某些情况下，ER和线粒体易位子的亚基本身被ERAD和MAD靶向。
目前，没有证据表明捕获的前体蛋白在叶绿体中类似地从TOC易位子去除，这可能与叶绿体蛋白质输入机制不太容易堵塞有关(可能由于更大的通道灵活性或更强的输入马达)。尽管如此，鉴于易位子旁边存在看似合适的装置(即Cdc48和PUX10)，如果发现叶绿体中存在类似的易位子清除机制也不会太令人惊讶。无论如何，CHLORAD的主要作用似乎是对TOC机制的直接调控，使其能够响应内部和环境信号进行动态重构。通过这种方式，CHLORAD控制细胞器的蛋白质组，并对其显著的形态、功能和发育可塑性做出贡献。
## 对人类健康和农业的影响
对ERAD在人类健康和疾病中重要性的理解不断深入。高度保守的ERAD组分如Hrd1和SEL1L(Hrd3)的缺失导致小鼠胚胎致死，这些组分的突变与蛋白质错误折叠疾病、代谢疾病(如糖尿病)和几种神经退行性疾病(包括人类肌萎缩侧索硬化和帕金森病)相关。Hrd1水平降低可导致错误折叠蛋白积累，并与人类阿尔茨海默病相关。通过去除受损、错误折叠或聚集的蛋白质，ERAD的核心要素在细胞健康中发挥关键作用，具有显著的治疗潜力。虽然研究努力理所当然地集中在同源哺乳动物系统上，研究人员建议研究植物中扩展的ERAD组分网络，例如通过植物和人类Hrd1复合物的比较结构和界面分析，可能提供进一步有价值的见解或治疗干预机会。基于植物衍生视角开发针对ERAD相关人类疾病的新颖疗法可能包括识别调控Hrd1稳定性的额外调控层，可能通过SEL1L-Hrd1结合的修饰。
植物ERAD组分的操作为改善生物和非生物应激条件下的作物性能提供了可能性。水稻和小麦中鉴定的ERAD相关E2和E3酶最近被证明调节油菜素内酯信号通路，这是促进细胞扩张和器官生长的关键激素系统。这些E2/E3酶的靶向操纵影响籽粒大小和重量，使ERAD成为作物改良的有前景靶标。
模式植物拟南芥中的研究揭示了CHLORAD在重构叶绿体蛋白质输入机制中的关键作用，这反过来促进负责细胞器显著结构和功能变化的细胞器蛋白质组动力学(即叶绿体和其他质体类型)，支撑主要植物发育转变。这一认识导致CHLORAD可能被操纵以有益地改变作物生长的不同方式。番茄中的原理验证提供了证据(果实成熟的特点是叶绿体向富含类胡萝卜素色素的亮红色色质体的显著转化)：CHLORAD活性降低的植物表现出果实成熟延迟，而活性增加的植物表现出成熟加速。果实成熟是主要的农艺重要性状，这种操纵例如可以被实施以促进货架期和减少浪费。根据发育背景，CHLORAD的操纵同样可以修改种子中的淀粉积累或延长叶片中的光合作用活性以提高产量。如前所述，CHLORAD在胁迫耐受性中也有重要功能(涉及限制过度光系统活性和随之而来的ROS产生)，进一步扩展了CHLORAD作为作物改良技术的潜在应用。
## 结语
UPS的靶向蛋白质降解对于维持平衡且响应迅速的蛋白质组、防止有毒蛋白质积累至关重要，因此在确保大量细胞功能中发挥核心作用。尽管UPS的主要组分局限于核质区室，但本文描述的Cdc48依赖性途径使定位于多种膜结合亚区室的众多蛋白质能够被接近，极大地扩展了系统的作用范围。如前所述，尽管各途径基于一些共同原理和过程(即泛素化级联、ATP驱动的逆易位和细胞质中的蛋白酶体降解)，但它们仍然被精细地调整以满足局部、细胞器特异性的需求。系统之间的显著差异涉及它们的底物、E3连接酶、逆易位子和Cdc48接头或招募蛋白；ER情况下不同功能在多功能蛋白中的组合；以及内共生细胞器情况下明显原核生物起源组分的利用。本文讨论的所有系统的一个迷人和反复出现的主题是与各自细胞器蛋白质输入机制的强功能联系，突显不同蛋白质稳态过程之间的紧密整合。尽管最近在理解细胞器泛素依赖性蛋白水解方面取得了显著进展，但仍有许多未解问题存在，因此该领域在可预见的未来承诺将是一个令人兴奋的发现领域。
### 未来挑战
突出问题涉及靶标选择、泛素化和呈递至Cdc48的分子细节，以及调控这些过程的调控步骤(如通过去泛素化和辅助因子)。泛素链拓扑结构的作用值得更仔细的关注，以及与提供细胞水平平衡蛋白质稳态的其他过程的相互作用也是如此。
另一个需要进一步调查的挑战领域是细胞内不同Cdc48依赖性途径之间的串扰，特别是在植物中，额外的CHLORAD途径提出了关于底物选择性、协调和调控治理的更高挑战。关于不同途径起源的进化问题，特别是内共生细胞器中的途径，既迷人又探索不足。
线粒体和叶绿体中细胞内泛素化的新兴证据挑战了与内共生细胞器中蛋白水解控制相关的长期范式。如果按字面理解，这些数据提出了关于相关泛素化机制的身份和定位、此类过程可能如何被调控，以及一旦修饰的靶标如何跨双层包膜输出以实现细胞质中蛋白酶体降解的额外有趣问题。
在未来，对这些关键蛋白水解系统的改进理解可能为治疗与蛋白质错误折叠和聚集相关的医疗条件(如神经退行性疾病和衰老)提供新途径，或导致创新方法以提高作物产量、抗逆性和植物健康，这对于应对气候变化背景下的粮食安全挑战至关重要。
