无动物皮肤致敏性测试：In Chemico与In Silico整合方法

《Toxics》：Animal-Free Skin Sensitization Testing: In Chemico and In Silico Integrated Approach

　　

化妆品领域动物测试禁令的日益严格推动了替代方法的发展，以确保消费者安全。皮肤致敏性（Skin Sensitization）是化妆品成分安全性评价中最关键的毒理学终点之一，需要严格评估以确保化妆品成分的安全性。本研究提出了一种整合测试策略（Integrated Testing Strategy, ITS），结合in chemico方法即直接多肽反应性测定（Direct Peptide Reactivity Assay, DPRA）与in silico方法即六平台计算预测体系，用于评估物质的致敏潜力。首先，通过部分能力验证程序对in chemico方法进行了验证，以确保实验可靠性。随后，该ITS被应用于Baccharis trimera提取物及其主要标志物3-咖啡酰奎宁酸（绿原酸/3-CQA）的致敏潜力评估。研究结果表明，按照OECD指南推荐，单独使用DPRA不足以对复杂混合物的致敏潜力进行分类。整合in silico数据对于解释植物基质的反应性至关重要，揭示了提取物中观察到的致敏潜力并非仅源于3-CQA，而更可能是由亲脂性更强的咖啡酰奎宁酸异构体的协同贡献所致。该方法表明，整合实验与计算方法对于稳健的安全性评估至关重要，为化妆品成分的早期无动物筛选以及复杂化学环境中致毒理学数据的精细化解读提供了一种高效策略。

## 研究背景与研究必要性

皮肤致敏性是由外源性物质暴露引发的毒理学终点，与一系列临床体征和症状相关，统称为变应性接触性皮炎（Allergic Contact Dermatitis）。多种化妆品成分可诱导此类反应，因此致敏潜力是化妆品商业化前安全性评价中最重要的参数之一。与传统局部刺激不同，变应性接触性皮炎源于适应性免疫应答，涉及两个不同阶段：诱导期，即初始暴露于过敏原触发先天免疫应答并导致记忆T细胞形成；以及激发期，即后续暴露引发临床可观察效应。传统上，研究人员利用小鼠局部淋巴结试验（Local Lymph Node Assay, LLNA）评估物质诱导的激发反应。然而，随着2012年皮肤致敏性不良结局通路（Adverse Outcome Pathway, AOP）的阐明，非动物方法得以发展，整体评估策略也逐步转向新 approach 方法学（New Approach Methodologies, NAMs）的视角。该AOP描述了导致T细胞激活的四个关键生化阶段：物质穿透角质层后与亲核蛋白的共价结合形成半抗原；通过Keap1/Nrf2信号通路激活角质形成细胞，触发抗氧化/electrophile反应元件（ARE）及炎症介质表达；皮肤树突状细胞特别是朗格汉斯细胞对抗原的识别，导致表面标志物的产生和差异表达；以及树突状细胞迁移至淋巴结、抗原呈递和T细胞增殖，最终导致后续暴露时的过敏反应激发。基于这些阶段的阐明，针对前三个关键事件的非动物试验得以开发验证，其中OECD测试指南442C描述的DPRA采用含半胱氨酸和赖氨酸的七肽模拟亲核皮肤蛋白，致敏化合物通过形成共价键与肽反应，导致其从反应介质中耗竭，可通过高效液相色谱（HPLC）进行定量。然而，该模型仅适用于单一成分物质或成分已知且稳定的混合物，多组分体系如植物提取物必须充分表征才能进行适当测试。计算毒理学中的定量构效关系（Quantitative Structure–Activity Relationship, QSAR）模型是该方法学的核心，通过分析结构相似性预测化合物的生物学行为。OECD及多个国际组织推荐整合使用in chemico、in vitro和in silico技术，即综合测试与评估方法（Integrated Approaches to Testing and Assessment, IATA），联合解读所得数据可准确预测化妆品成分的皮肤致敏潜力。

## 研究目的与技术方法

本研究旨在通过使用部分参考物质展示DPRA部分能力验证，并将这些实验数据与全面的in silico预测体系整合，评估该ITS在预测B. trimera水醇提取物及其主要成分3-CQA皮肤致敏潜力方面的适用性，为复杂植物基质的安全性评估提供稳健的权重证据（Weight-of-Evidence, WoE）框架。

本研究所用的主要关键技术方法包括：一是DPRA in chemico实验，采用含半胱氨酸（Ac-RFAACAA-COOH）和赖氨酸（Ac-RFAAKAA-COOH）的七肽作为合成亲核靶标，通过HPLC测定肽耗竭率，使用OECD TG 442C规定的Cysteine 1:10/Lysine 1:50预测模型进行反应性分类；二是六平台in silico计算预测体系，包括ADMET Predictor?（评估亲脂性S+logP、皮肤渗透及皮肤致敏性）、OECD QSAR Toolbox（采用Read-across分析和SS AW for DASS自动化工作流）、StopTox、Pred-Skin、Vega QSAR和Danish QSAR数据库，所有预测严格限定在模型适用域（Applicability Domain, AD）内且置信度≥70%；三是植物提取物的色谱表征，采用Agilent Infinity 1260 HPLC系统配备C18色谱柱进行定性定量分析，以3-CQA为主要化学标志物。

## 研究结果

**DPRA部分能力验证**：对两种肽的分析响应均呈线性行为，决定系数R² > 0.99，表明色谱峰面积与肽浓度成正比。参考控制A、B、C均满足接受标准（0.50 ± 0.05 mM，变异系数CV < 15%）。能力验证化学品的测定结果满意，所有情况下半胱氨酸和赖氨酸肽耗竭值的标准差均满足接受标准（分别<14.9%和<11.6%）。1-氯-2,4-二硝基苯、肉桂醛、丁烷-2,3-二酮均归类为高反应性（致敏物），丁-1-醇归为最小反应性（非致敏物）。但值得注意的是，肉桂醛与赖氨酸肽反应时观察到轻微浑浊，导致耗竭值（18.31%）低于预期值（40.2%）。

**In Silico工具评估致敏潜力**：六平台计算预测体系对参考物质的预测显示高度一致性，1-氯-2,4-二硝基苯和肉桂醛均被所有适用平台一致且正确地预测为阳性，丁-1-醇在所有工具中均被一致预测为阴性。但对于丁烷-2,3-二酮这一弱/中度致敏物，出现了冲突预测：ADMET Predictor?、QSAR Toolbox、Vega QSAR和Danish QSAR正确预测为阳性，而StopTox将其归类为阴性，Pred-Skin则判定其超出适用域。ADMET Predictor?生成的理化描述符显示，皮肤渗透性主要受亲脂性和分子量影响，尽管1-氯-2,4-二硝基苯在DPRA中表现出更高的实验反应性，但丁烷-2,3-二酮因分子量较低而显示出更高的计算皮肤渗透值。

对于B. trimera提取物的植物化学标志物，3-CQA的in silico预测凸显了复杂多酚结构建模的固有挑战。仅ADMET Predictor?能够准确预测其阴性致敏潜力（73%置信度），与实验in chemico结果完全一致；其他平台要么预测假阳性（主要归类为弱Category 1B致敏物），要么判定其超出适用域。然而，随着咖啡酰基团的添加，衍生物结构复杂性增加时，多数平台（ADMET Predictor?、QSAR Toolbox、StopTox、Pred-Skin和Danish QSAR）达成共识，将二咖啡酰奎宁酸（diCQA）和三咖啡酰奎宁酸（triCQA）标记为潜在致敏物。ADMET Predictor?的理化描述符揭示了这一趋势的明确规律：咖啡酰基团的逐步添加显著增加了亲脂性（S+logP从3-CQA的-0.398升至3,4,5-triCQA的2.968）和理论皮肤渗透性（从0.153 × 10^-7 cm/s增至264.818 × 10^-7 cm/s）。

**B. trimera提取物、绿原酸及其异构体的毒理学特征与整合分析**：B. trimera水醇提取物（HAE）的干残重为0.0192 ± 0.02534 g/g，密度为1.0116 g/mL（26.5 °C），总绿原酸含量为0.27%，pH为4.59。在DPRA中，HAE被归类为致敏物，但呈现低效力肽耗竭值11.5%。然而其主要成分3-CQA完全呈阴性结果，这一明显差异揭示了仅依赖分离化学标志物表征粗提物的固有局限性。

通过ITS整合in chemico和in silico方法解决了这一局限性。六平台in silico联合预测显示，diCQA和triCQA的增加显著提升了分子的亲脂性和皮肤渗透能力，从而增强了其穿透角质层并与皮肤蛋白亲核位点相互作用的可能性。这些衍生物从单咖啡酰到多咖啡酰的结构演变引入了与儿茶酚前半抗原激活机制相关的关键化学变量：含有儿茶酚环的酚类结构本身并不具有高度亲电性，需要通过化学或酶促氧化转化为活性邻醌，才能作为强效的Michael受体进行蛋白半抗原化。diCQA和triCQA中多个咖啡酰基团的存在在结构上增加了每个分子的反应中心数量，显著加速了累积自氧化速率并实现了与蛋白亲核试剂的多价交联。DPRA中半胱氨酸测定的pH限制（7.5）可能导致单一儿茶酚犯了在标准24小时孵育期内自氧化动力学过慢而无法触发显著肽耗竭，而in silico平台基于结构警报评估风险则不受此实验pH限制。

## 讨论与结论

本研究成功实施并验证了一种用于皮肤致敏性筛选的ITS，结合in chemico（DPRA）和in silico方法。DPRA部分能力验证的展示以及六平台in silico预测体系的高度一致性，确认了该整合框架在危害识别中的可靠性。尤为重要的是，计算工具的整合对于解释复杂植物基质中的实验结果至关重要，B. trimera提取物的致敏潜力不能归因于单一标志物（3-CQA），而是其咖啡酰奎宁酸衍生物的累积反应性和增强皮肤渗透的协同结果。这些发现凸显了多工具WoE框架相对于依赖孤立标志物或单一预测模型的必要性。

该ITS为化妆品成分的不适用早期排除提供了一种省时且经济的筛选策略。研究结果同时强调了对现有验证试验适用域进行批判性重新评估的必要性，特别是关于刚性实验边界条件（如测定pH）如何限制in chemico检测前半抗原自氧化动力学的能力。通过弥合孤立标志物测试与植物混合物复杂反应景观之间的差距，本研究为化妆品原料的安全性评估提供了一条稳健的无动物方法学路径。

未来研究需要将该DPRA能力验证扩展至完整的十项参考物质集合，并进一步扩大化学品的多样性以增强该整合方法的可靠性和稳健性，特别是在应用于B. trimera等植物衍生提取物的复杂基质时。该ITS旨在作为基础框架，未来涉及更大量植物成分数据集的研究将是进一步拓宽适用域并进行广泛外部基准测试的逻辑下一步，从而增强对这些无动物方法学的监管信心。