声等离子体水处理技术对植物病原真菌的作用：黑色素化物种与透明物种的响应差异

《Journal of Fungi》：Sonoplasma Technology for Water Treatment Against Phytopathogenic Fungi: Responses of Melanized and Hyaline Species

　　

声等离子体处理（SPT），即水体中流体动力学空化与低温等离子体放电相结合的高级氧化工艺，已被提出用于降低生物污染。SPT通过产生物理应激因子和活性氧物种（ROS），包括过氧化氢（HP），可使微生物失活，但其对耐应激丝状真菌的作用尚缺乏充分表征。本研究考察了两种色素表型 contrasting 的植物病原真菌：黑色素化的链格孢（Alternaria alternata）和透明的茄病镰孢（Fusarium solani）。孢子悬浮液在30 kHz条件下接受直接和间接SPT处理，并在处理后即时及储存后评估活力、生物量积累、分生孢子产量、化感活性及与色素相关的光谱响应。茄病镰孢表现出更高的敏感性，其菌落形成能力下降，生物量产生受抑，但存活繁殖体显示孢子形成增加。相比之下，链格孢在测试条件下维持可活生长，并表现出生长相关和繁殖终点指标的增强，同时菌落色素沉着加深。这些响应与色素沉着相关的SPT诱导物理和氧化应激耐受性一致，但并未确立黑色素素为唯一因果机制。因此，SPT对丝状真菌的功效具有物种依赖性，且在存在耐药的黑色素化类群时可能受限。

声等离子体水处理技术对植物病原真菌作用机制的差异性研究

**研究背景与问题提出**

生物污染，即水体生态系统及饮用水被病毒、细菌、真菌和原生动物等病原体及其他微生物污染，对公共健康和生态系统构成持续性威胁。在这一系列污染物中，真菌因其复杂的细胞结构和持久的生活史阶段而尤为难以控制和消毒。在水系统中，真菌以分散孢子和菌丝聚集体两种形式存在，其中菌丝聚集体构成生物膜的结构核心，这种生长模式显著增强了真菌对环境胁迫的耐受能力。包括抗逆性孢子和复杂生物膜在内的这些韧性形态，对消毒处理构成特殊挑战，因为这两种生活史阶段均表现出对化学和热冲击的显著抗性。在水生环境中，子囊菌门（Ascomycota）的丝状真菌占主导地位，频繁分离到的属包括曲霉属（Aspergillus）、链格孢属（Alternaria）、青霉属（Penicillium）、木霉属（Trichoderma）、枝孢属（Cladosporium）和镰孢属（Fusarium），其中许多种类具有重要的植物病理学和公共卫生意义。

传统的真菌污染管理策略涵盖化学和物理方法。化学消毒通常依赖强效氧化剂，包括氯类化合物、过氧乙酸、臭氧和过氧化氢等。大量化学消毒研究报道，黑色素化真菌表现出更强的耐药性，黑曲霉（Aspergillus niger）常被鉴定为最耐受的物种。同样，物理方法中最常见的非化学途径——紫外线（UV）辐照，也揭示了不同真菌属之间敏感性的广泛差异。尽管UV灭活对多种真菌有效，但抗性水平差异显著：非黑色素化物种如茄病镰孢（F. solani） consistently 位于抗性最低之列，而黑色素化真菌如枝孢属（Cladosporium sp.）则表现出高得多的存活率。这表明内在细胞特征而非特定的灭活方法是决定存活的重要因素，这一观察甚至延伸至采用超声波或冲击波的机械消毒策略，真菌细胞壁的结构和化学韧性继续在抗性中发挥关键作用。

鉴于传统方法的局限性和可变效果，高级氧化工艺（AOPs）作为有前景的替代方案被开发出来。这类技术的特征是能够产生强大的非选择性氧化剂，主要是活性氧物种（ROS）。经典消毒方法如UV辐照常被整合入AOPs中，或通过联合化学物种（如UV/H₂O₂系统），或在增强ROS生成的特殊条件下实施。该领域的最新进展是声等离子体处理（SPT），这是一种将流体动力学空化与低温等离子体放电直接整合于水体中的组合AOP。这种协同组合产生多组分胁迫环境，其特征为局部极端温度、强冲击波、电磁场以及水分子解离——后者导致ROS的大量形成，包括羟基自由基（•OH）、HP（H₂O₂）和臭氧（O₃）。SPT的功效已针对一系列有机污染物（如甲醇、抗生素和染料）和生物污染物（大肠杆菌、酿酒酵母以及灌溉水中的细菌-真菌复合群落）得到证实。其作用机制被认为涉及两方面：一是空化和冲击波对细胞膜的物理破坏，二是ROS造成的氧化损伤——这些ROS可损伤线粒体等细胞器，并干扰三磷酸腺苷（ATP）合成等关键代谢系统。

然而，尽管SPT对细菌如大肠杆菌和酵母酿酒酵母表现出高效性，其与子囊菌门丝状真菌的相互作用却复杂得多。研究表明，应用于温室灌溉水中细菌-真菌复合群落的SPT，对丝状真菌的功效显著低于对细菌的作用。在生长的丝状真菌菌落中，高比例的是透明菌丝形态，包括大多数植物病原性镰孢属物种；而青霉属、木霉属、枝孢属和链格孢属的菌落则较少见。这种真菌抗性与细胞壁的复杂结构有关，细胞壁含有几丁质，在许多类群中还含有酚类色素黑色素。黑色素在生理和生态上发挥重要作用，通过清除ROS、减轻UV诱导损伤以及增强黑色素化形态的结构完整性和毒力，赋予广谱抗性。但一个重大的知识缺口仍然存在：色素沉着相关特征如何调控丝状真菌对SPT施加的组合胁迫的生理响应，仍缺乏充分表征。

一个相关的解释框架是毒物兴奋效应（hormesis），即低水平的毒性或物理应激因子触发刺激效应，而高剂量导致细胞抑制或死亡的剂量-响应关系。这一现象在真菌中也有记录，例如HP已在酿酒酵母中诱导毒物兴奋效应。然而，色素沉着相关耐受性与处理后生理恢复之间的关系尚未被探索，特别是色素沉着相关特征是否足以缓冲SPT诱导的氧化应激，从而将响应从灭活转向恢复、刺激或繁殖增强，尚不清楚。

基于此，研究人员采用双物种比较模型，检验对比性色素表型是否与对声等离子体诱导胁迫的不同生理响应相关。研究比较了两种具有广泛相似生长特征但具有不同色素特性的植物病原真菌：黑色素化的链格孢和透明的茄病镰孢。该设计并非直接检验黑色素素的因果性，而是评估色素沉着相关特征如何影响真菌在SPT后的存活、生长恢复、孢子形成、溶解性有机化合物谱、化感活性及色素沉着响应。这些终点指标在SPT处理后即时及储存后评估，以区分即时灭活与持续或延迟的生理效应。此方法使研究人员能够在受控实验室条件下评估SPT的抗真菌功效和潜在选择性，并识别抗性真菌表型是否需要优化或补充的水处理策略。

**关键技术方法**

研究用到的主要技术方法包括：（1）声等离子体处理系统：采用30 kHz交流电频率的流通式反应器，流速12 L/min，样品单次循环体积5-7 L，温度变化1-3°C，设置双倍（2×）和四倍（4×）通过模式，以及直接SPT（孢子直接接触等离子体放电）和间接SPT（孢子暴露于SPT处理后水）两种暴露方式；（2）真菌活力与生长定量：包括菌落形成单位（CFU）计数、分生孢子生产力测定（血球计数板）和菌丝生物量干重测定；（3）HP暴露对照实验：外源HP（2和6 mmol/L）作为可测量的氧化应激参考；（4）化感活性生物测定：以燕麦（Avena sativa L.）为模型植物，测定挥发性和气载真菌代谢物的生长抑制效应，计算化感活性系数（Ca）；（5）光谱分析：采用UV-Vis分光光度计测定200-800 nm吸收光谱，以及荧光光谱仪测定270 nm和310 nm激发波长下的荧光发射光谱。

**研究结果**

**水质化学参数分析**：SPT导致水体轻微碱化并增加HP浓度。HP浓度随处理强度增加，四倍处理模式下达2.70±0.05 mmol/L。储存期间HP浓度逐渐下降。

**新鲜处理孢子悬浮液的真菌生长**：透明真菌茄病镰孢对直接SPT更敏感，萌发时间延长，菌落形成能力下降，尤其在10²和10⁴ conidia/mL两种初始孢子密度下均如此，四倍处理强于双倍处理。尽管菌落形成能力下降，存活菌落的孢子生产力却增加约5.3-6.1倍（双倍处理）和3.6-4.0倍（四倍处理）。生物量受处理强度和初始孢子密度影响：10² conidia/mL时仅双倍处理显著降低生物量，10⁴ conidia/mL时双倍和四倍处理均降低生物量。

黑色素化真菌链格孢表现不同：萌发延迟未改变，双倍和四倍处理后均维持草坪生长。孢子生产力较未处理对照增加约1.4-1.5倍。菌丝生物量也增加，处理培养物产生约1.8-2.9倍于对照的生物量。固体培养基上的菌落和液体培养中的颗粒均较未处理对照颜色更深。

**溶解真菌代谢物的光谱分析**：链格孢培养物的吸收光谱显示，处理后UV范围（200-400 nm）吸光度高于对照，与处理组更高的菌丝生物量一致。I带（最大吸收约270 nm，与芳香族氨基酸如酪氨酸和色氨酸或蛋白质样化合物相关）的增加较II带（最大吸收305-310 nm，与其他溶解性真菌代谢物相关）更为显著。荧光光谱与吸收数据一致，处理组荧光发射强度更高，蓝色区域（400-500 nm）的宽发射带（可能包括黑色素样化合物和/或细胞电子供体NAD(P)H的贡献）在处理样品中更强。HP处理组未显示类似的蛋白质样或色素相关化合物光谱区域增加。

**真菌培养物对高等植物的化感活性**：链格孢对燕麦幼苗生长的抑制效应强于茄病镰孢。四倍SPT处理组的化感活性系数（Ca）最高（Ca > 0.5），表明SPT处理的链格孢培养物产生更强的燕麦根和胚芽鞘生长抑制。

**SPT处理后长期储存的真菌生长**：储存后茄病镰孢孢子悬浮液的培养力下降，处理后孢子通常比对照需要更长时间萌发，CFU计数减少。10² conidia/mL时，四倍处理储存10天后无菌落回收，双倍和四倍处理储存30天后均无回收；10⁴ conidia/mL时，四倍处理30天后无回收，双倍处理后仍有少量菌落。链格孢呈现对比模式：SPT处理后储存的孢子悬浮液CFU计数常高于相应对照，尽管效应大小和统计显著性因处理模式、储存时间和初始孢子密度而异。

**SPT处理水中的真菌生长**：SPT处理水的效应弱于直接SPT暴露。生物量无显著差异，CFU计数也无显著差异。但分生孢子生产力呈物种特异性响应：链格孢无显著变化，茄病镰孢在即时处理和10天储存后显著增加，30天后不再显著。

**HP暴露下的真菌生长**：HP对透明茄病镰孢的影响强于黑色素化链格孢。6 mmol/L HP强烈降低茄病镰孢生物量和CFU恢复，伴随孢子生产力约5.8倍增加。链格孢在测试条件下未受显著影响。

**讨论与结论**

SPT对两种测试植物病原真菌产生不同效应。透明茄病镰孢在直接孢子悬浮液处理时主要表现为抑制响应，而SPT活化水的主要可检测效应是孢子生产力增加而非活力或生物量降低。黑色素化链格孢则维持可活生长，甚至在直接SPT暴露后显示多种生长相关和繁殖终点指标的刺激。这些结果表明SPT的生物学结果不仅取决于处理强度，还取决于真菌物种特征，可能包括色素沉着相关的应激耐受性。

两种真菌孢子生产力的增加应谨慎解读，因为增强的孢子形成不一定表明生理状态改善。在真菌中，孢子产量增加可能是胁迫响应的一部分，反映有利于孢子形成的条件常与最大营养生长条件不同。直接SPT和HP暴露下茄病镰孢减少的菌落发育伴随孢子增加，提示应激相关的从营养生长向繁殖输出的转变。

某些处理变型中观察到的刺激可在毒物兴奋效应框架下讨论，即低或亚致死水平的应激因子刺激生物活性，而较高水平导致抑制或死亡。但本研究未直接解析该响应的机制。SPT产生涉及水分子解离、ROS形成、冲击波、电磁效应和局部极端温度的复杂应激环境，因此观察到的刺激响应应视为处理相关的生理效应，而非单一因果途径的证据。

HP作为SPT的可测量化学结果，浓度在处理依赖方式下增加，四倍SPT后达2.70±0.05 mmol/L。HP因此可视为SPT过程中形成的关键可测量氧化效应物，但不能代表完整的声等离子体过程，因为直接SPT还包括机械和电磁应激因子。HP是相对长寿命的ROS，能扩散通过膜脂双层，改变膜通透性并氧化细胞内靶标。然而，抗性微生物常需要较高抑制浓度，联合处理往往更有效。

真菌拥有针对氧化应激的强大防御系统，这对植物病原真菌在宿主组织中的定殖和存活至关重要。链格孢和镰孢属真菌中已记录对HP的抗性。本研究中两物种的对比响应与氧化应激管理的物种特异性差异一致。黑色素是真菌抗氧化的重要组分，链格孢的黑色素产生主要通过DHN途径，涉及pksA、brm2基因和转录因子CmrA等，该途径不仅与色素沉着相关，还与形态发生、孢子形成和环境胁迫耐受性相关。SPT后链格孢更深的色素沉着与保护性或补偿性响应的激活相容。但由于本研究比较的是两个自然物种而非黑色素缺陷突变体或化学抑制黑色素化变型，结果应解读为与色素沉着相关耐受性一致，而非黑色素素单独导致观察到的抗性的直接证据。

SPT活化水中处理后孢子生产力的增加也与适度HP暴露可诱导毒物兴奋效应的先前证据一致。放电活化水中含残余HP，在某些间接处理变型中增加茄病镰孢的孢子生产力，这与处理水中残余氧化活性在某些条件下可作为亚致死信号的可能性兼容，尽管HP的贡献无法完全与其他SPT诱导的水化学变化分离。

机械效应也可能促进对直接SPT的生物学响应。冲击波可通过损伤细胞结构、破坏膜或产生足以导致微生物细胞尺度结构失败的压力梯度来灭活微生物。SPT期间的快速局部加热促进蒸汽泡形成和崩溃，产生损伤微生物细胞的机械力。然而，冲击波的兴奋性刺激在微生物系统中尚未见报道，因此更可能是在直接SPT期间与细胞损伤相关，而活化水间接暴露后观察到的刺激效应更可能与处理介质中的持久化学变化相关。

SPT期间的温度效应本身不太可能解释物种对比。两个菌株均分离于相似温度环境的生境，属中温型，最适生长温度22-28°C。但黑色素化真菌可能对热应激更耐受，升高的温度可刺激黑色素合成和部分蛋白质降解，产生酪氨酸酶依赖性黑色素形成的前体。

综合而言，链格孢比茄病镰孢更能耐受SPT产生的组合应激。从透明茄病镰孢的抑制到黑色素化链格孢的刺激的转移，与色素沉着相关特征可缓冲氧化和物理应激的假设一致。但其他种间差异，包括抗氧化酶活性、膜组成、恢复能力和储存耐受性，也可能有贡献。四倍SPT后链格孢化感活性的增加进一步表明，SPT诱导的应激可能不仅改变生长和孢子形成，还改变挥发性介导的生长抑制活性。这对水处理应用很重要，因为抗性真菌繁殖体处理后的存活可能伴随生理活性的改变。但SPT处理后的繁殖体是否保持或改变对植物宿主的致病性尚未测试，应在未来工作中直接用适当的接种试验评估。

该双物种模型表明，SPT对丝状真菌的功效具有物种依赖性，且在存在抗性黑色素化类群时可能受限。发现支持优化SPT参数并在实际应用前评估目标微生物群落的必要性。未来研究应包括更广泛的真菌面板、黑色素缺陷或抑制菌株、直接黑色素定量、黑色素化和氧化应激基因表达分析、HP剂量-响应和浓度-时间响应试验、纯水中通量等效HP对照，以及在自然水或废水中的验证。这些实验将有助于区分SPT的化学、机械、电磁和热组分的相对作用，并确定此处观察到的色素沉着相关耐受性是否更普遍地适用于丝状真菌。最终研究结论为：声等离子体处理对两种对比性色素表型的植物病原真菌产生物种特异性效应，直接SPT降低透明茄病镰孢的活力和生物量产生，而黑色素化链格孢在测试条件下维持可活生长并显示生长相关和繁殖终点指标的刺激；两物种处理后均显示孢子增加，表明孢子产生应解读为应激相关响应而非处理成功的简单度量；观察到的茄病镰孢与链格孢之间的对比与色素沉着相关的SPT诱导氧化和物理应激耐受性一致，但基于两个自然物种的研究未包括黑色素缺陷突变体、直接黑色素测量或分子验证，故未确立黑色素素为唯一因果机制；直接和间接SPT暴露可导致不同生物学结果，直接处理对易感透明真菌更有效，而活化水单独在某些条件下增加茄病镰孢的孢子生产力；SPT对丝状真菌的功效在存在抗性黑色素化类群时可能受限，实际应用需优化处理强度、暴露持续时间和重复处理方案，并在混合微生物群落和环境真实水体中进行验证，同时确定存活真菌繁殖体是否保持或改变对植物宿主的致病性。