摘要
Ilyonectria是一种常见的土壤真菌属，包含多种能感染多种农作物、药用植物及园艺植物的病原菌。然而，由于缺乏可靠高效的基因转化方法，严重阻碍了人们对Ilyonectria病原菌致病机制的研究。在本研究中，我们为两种主要的Panax根腐病病原菌I. robusta和I. vredehoekensis建立了高效的原生质体介导的基因转化方法。我们系统优化了高质量原生质体制备的关键参数，包括菌丝培养时间、酶的组成、渗透稳定剂类型、消化速度以及消化时间。随后通过正交实验优化了PEG-CaCl2介导的转化条件，并筛选出了适合原生质体再生的培养基。最优的酶组合为20 mg/mL的driselase和10 mg/mL的溶菌酶，以0.7 M的NaCl作为渗透稳定剂。在此条件下，I. vredehoekensis在150 rpm下消化3小时后可获得高活力且质量良好的原生质体，而I. robusta在100 rpm下消化2小时后也可获得类似的高质量原生质体，其浓度分别达到5.52 × 107 CFU/mL和5.75 × 107 CFU/mL。使用由甘露醇配制的STC缓冲液结合40%的PEG4000可实现高效的转化效果。PCR检测和荧光显微镜观察均证实了存在阳性转化体。此外，致病性试验显示，转化株与野生型菌株之间的毒力没有显著差异，这说明该转化过程并未改变菌株的毒力。据我们所知，这是首项成功为I. robusta和I. vredehoekensis建立基因转化方法的研究，为功能基因分析、致病性研究以及宿主-病原体相互作用研究提供了重要的技术平台。同时，这一优化的转化策略也可为其他Ilyonectria物种的研究提供参考。
