一种基于重组酶聚合酶扩增结合侧向层析测定从临床样本中即时诊断副球孢子菌病的新型分子检测方法

《Journal of Fungi》：A Novel Molecular Assay for Point-of-Care Diagnosis of Paracoccidioidomycosis from Clinical Samples Using Recombinase Polymerase Amplification Coupled with a Lateral Flow Assay

　　

副球孢子菌病（PCM）是拉丁美洲流行的一种系统性真菌病。其诊断常被延误，原因在于流行地区缺乏可及且快速的分子检测工具。在本研究中，研究人员开发并初步评估了一种重组酶聚合酶扩增检测结合侧向层析读出（RPA-LFA），用于利用参考菌株和从临床标本中提取的脱氧核糖核酸（DNA）对副球孢子菌属（Paracoccidioides spp.）进行属水平检测。该检测方法靶向ITS1–5.8S–ITS2核糖体区域，使用双标记引物，可在LFA试纸条上实现视觉检测。分析特异性、分析灵敏度和临床一致性通过参考菌株、非目标微生物和探索性临床样本集进行评估。未观察到与粗球孢子菌（Coccidioides posadasii）、埃蒙斯菌（Emmonsia crescens）、荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）或巴西利什曼原虫（Leishmania braziliensis）的交叉反应。初步分析检出限（LOD）为100拷贝/μL。视觉结果在35分钟内获得，包括39°C下20分钟的扩增和15分钟的LFA读出。在分析的临床样本集中，该检测方法显示出与直接显微镜检查完全一致性。RPA-LFA方法通过结合等温扩增、短周转时间、视觉解释和低设备要求，解决了常规分子检测方法的若干操作局限性。这项工作为临床标本中副球孢子菌检测的面向即时检测的分子方法提供了概念验证。需要进一步在更大且更多样化的临床队列中进行验证，以确立其诊断性能和在流行地区实施的潜力。

在拉丁美洲流行地区，副球孢子菌病（PCM）作为一种系统性真菌病，长期面临诊断延迟的困境。该疾病由副球孢子菌属（Paracoccidioides）的热双相型真菌引起，主要包括巴西副球孢子菌复合体（P. brasiliensis complex）和卢茨副球孢子菌（P. lutzii）。由于患者多分布于医疗资源匮乏的农村地区，传统诊断方法如真菌培养耗时冗长且需生物安全防护，直接显微镜检查则受限于操作者经验及样本中真菌负荷量的影响，灵敏度波动较大。尽管聚合酶链式反应（PCR）等分子检测技术已展现出优异的诊断潜力，但其对热循环仪、稳定电力供应及专业实验条件的高度依赖，使其难以在基础设施薄弱的外围医疗机构推广。世界卫生组织（WHO）于2022年将副球孢子菌列入真菌优先病原体清单，凸显了加强该病诊断能力建设的紧迫性。

在此背景下，研究人员致力于开发一种面向即时检测（point-of-care）的简化分子诊断平台。该研究的核心目标为构建并初步评估基于RA（recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增）耦合侧向层析测定（LFA）的检测体系，实现从临床样本中快速、特异地检出副球孢子菌属DNA。该平台设计注重低设备复杂度与结果可视化，以期突破资源受限环境下的诊断瓶颈。

研究所采用的关键技术方法主要涵盖以下方面：在分子靶标选择上，针对真菌基因组中高拷贝的ITS1–5.8S–ITS2核糖体区域设计扩增策略，利用生物素（biotin）和地高辛（digoxigenin）双标记引物生成免疫色谱可识别的扩增产物；等温扩增环节采用TwistAmp?基础试剂盒在39°C条件下进行20分钟反应；侧向层析检测基于金纳米颗粒-链霉亲和素偶联物与抗地高辛抗体的免疫反应，15分钟内完成视觉判读；分析特异性评估纳入了多种系统发育相关或临床鉴别诊断相关的非目标微生物；临床样本验证则使用来自阿根廷国立东北大学区域医学研究所（IMR, UNNE）的8份经知情同意获取的患者标本。建立初步分析检出限（LOD）时，通过Qubit荧光定量仪精确定量纯化扩增子，制备十倍梯度稀释样本进行三重重复检测。

研究结果部分按以下小标题依次展开：

第一项结果为RPA扩增验证。研究人员对三株副球孢子菌参考菌株进行扩增，琼脂糖凝胶电泳显示均产生约242 bp的预期单一条带，证实引物对在属内不同成员间具有扩增兼容性；非目标菌株及无模板对照均未出现扩增产物，表明反应体系条件适宜且特异性良好。

第二项结果为RPA-LFA分析特异性评估。视觉判读结果显示，所有副球孢子菌株样本均呈现测试线与控制线双阳性，而粗球孢子菌、埃蒙斯菌、荚膜组织胞浆菌、巴西利什曼原虫及无模板对照仅显示控制线，未出现交叉反应或无效结果，证明该检测具有属水平特异性。

第三项结果为初步分析检出限评估。使用十倍梯度稀释的纯化DNA（10⁴至10⁰拷贝/μL）进行检测，10⁴、10³及10²拷贝/μL浓度下所有重复均为阳性；10拷贝/μL时仅33%重复检出，1拷贝/μL时均为阴性。据此将初步分析LOD确定为100拷贝/μL，该数值为纯化DNA在理想实验室条件下的估计值，未考虑提取效率或样本基质抑制效应。

第四项结果为临床样本中副球孢子菌DNA的检测。研究纳入2份淋巴结抽吸物、2份痰液、2份皮肤刮屑及2份皮肤活检，每种类型各含显微镜阳性及阴性样本各1份。所有显微镜阳性样本RPA-LFA均为阳性，阴性样本均为阴性，总一致性达8/8（100%），提示该检测可适用于多种常见临床基质，但因样本量有限，尚不能作为诊断灵敏度和特异度的定论。

讨论部分中，研究人员系统阐述了该研究的意义与局限性。RPA-LFA平台的核心优势在于整合等温扩增与视觉读出，将总检测时间压缩至约35分钟，且无需热循环仪或复杂光学设备，符合WHO热带病研究规划署（TDR）提出的ASSURED标准框架（经济可承受、操作简便、结果快速、性能稳健、设备需求最小、可及性高），特别适用于基础设施薄弱的流行地区。属水平检测虽不足以区分具体物种，但在临床实践中已能满足快速确认感染、指导经验性抗真菌治疗的首要需求。研究人员同时坦陈若干局限：临床样本量过小（n=8）阻碍了对诊断准确性指标的稳健估计；仅以显微镜作为参照标准存在局限，未来需与培养、组织病理、常规PCR及实时荧光定量PCR（real-time PCR）等方法比较；非目标微生物panel有待扩展；当前依赖商业试剂盒提取纯化DNA的流程尚不适于现场快速检测，需开发热裂解、化学裂解等简化前处理方法；LFA结果的主观视觉判读可能引入观察者间变异，未来可探索数字化读数或智能手机辅助判读策略；试剂的稳定性及非常温储运条件下的性能亦需评估。

研究结论部分指出，本研究所开发的RPA-LFA检测为副球孢子菌病提供了一种有前景的快速、属特异性、可视化的分子检测方法。通过将等温扩增与侧向层析检测相结合，该检测降低了对复杂实验室设备的依赖，为基础设施受限场景下的常规PCR提供了实用替代方案。在评估条件下，该平台展现出属水平特异性、100拷贝/μL的初步分析检出限，以及在探索性临床样本集中与直接显微镜检查完全一致的优良表现。其短周转时间、低温扩增需求及简便视觉读出的操作特性，支持其作为即时检测或近患者诊断策略的潜在应用价值。然而，该研究应被理解为概念验证而非确定性临床验证。未来仍需在更大规模、更多样化的临床队列中开展验证研究，评估简化DNA提取方案、扩展特异性验证panel、不同操作者间的可重复性、内扩增对照的纳入，以及真实实施条件下的现场性能表现，从而确立该平台的实际可扩展性与临床应用价值。