基于纸质环境质谱技术结合样品预处理与富集的唾液皮质醇定量分析

《Analytica Chimica Acta》：Salivary Cortisone Quantification by Paper-Based Ambient Mass Spectrometry with Integrated Sample Cleanup and Enrichment

　　谭腾婷|周玉峰|巴里·史密斯|乔安妮·C·布莱尔|西蒙·马赫
英国利物浦大学电气工程与电子学系，利物浦

摘要
唾液中的皮质酮与血清游离皮质酮的关联度高于唾液皮质酮本身，因此它是评估肾上腺功能最具临床价值的无创标志物。然而，由于其浓度极低，目前只能通过实验室的高性能液相色谱串联质谱技术进行精确检测。该技术需要大量样本量，并且涉及复杂的离线前处理步骤，这使得那些无法提供足够样本量的患者难以接受检测，包括儿童、老年人和口干症患者。本文首次报道了一种基于环境质谱的技术，能够在临床相关范围内实现对健康人唾液中这种内源性类固醇生物标志物的检测，其精度可与UHPLC-MS/MS相媲美。所采用的纸喷雾电离质谱技术将提取、分析物富集和电离过程整合在一张一次性纸载体上。仅需4微升唾液即可完成皮质酮的定量分析，相比UHPLC-MS/MS所需样本量减少了50倍，且检测时间不超过10分钟。该方法已符合ICH M10生物分析标准，其最低检测限为0.5纳克/毫升，精密度≤8.4%相对标准偏差，准确率为96%至105%，线性范围为0.5至50纳克/毫升，且不存在显著基质干扰。在28份样本中与UHPLC-MS/MS方法进行的交叉验证显示，两者结果高度一致（平均差异为4.17±6.98%）。与皮质醇不同，皮质酮不会出现共洗脱的异构体干扰，因此非常适合无需色谱分离的环境分析。这一技术为那些无法接受传统实验室检测方法的人群提供了实用的内分泌疾病诊断手段。

1. 引言
唾液皮质酮作为一种强大的无创生物标志物，可用于评估全身皮质酮水平，在库欣综合征和肾上腺功能不全的诊断及监测中具有重要价值[1]–[4]。与普通人群相比，这两种疾病会导致更高的发病率和死亡率[5]–[9]，但由于症状往往不典型，容易导致诊断延误。仅在英格兰，每年就要进行至少92,000次用于诊断原发性肾上腺功能不全的金标准检测——短效促肾上腺皮质激素试验，每次检测费用约为400英镑[10]。虽然夜间测定唾液皮质酮已被视为疑似库欣综合征的一线筛查方法[11]，但唾液皮质酮可能更具优势：由于唾液腺中的11β-羟基类固醇脱氢酶2型会迅速将皮质醇转化为皮质酮，因此唾液中的皮质酮浓度是唾液皮质酮的4–10倍[12]–[16]；在皮质醇浓度过低而无法检测时，唾液皮质酮仍可保持可检测水平；此外，口服替代疗法、外用药物或甘草摄入带来的外源性氢化可的松也不会影响检测结果[4]、[17]、[18]。此外，唾液皮质酮与血清游离皮质酮的关联度也高于唾液皮质酮本身[2]–[3]，这表明它可能更适合作为判断皮质酮过多或不足的特异性生物标志物。

尽管具有这些临床优势，但常规检测唾液皮质酮仍面临诸多分析难题。免疫分析法虽被广泛使用，但存在与结构相似的类固醇发生交叉反应的问题，且检测时间通常超过2小时[19]–[20]。而高性能液相色谱串联质谱技术虽然具有较高的选择性和灵敏度，但需要50–250微升的样本量，同时还需经过复杂的离线前处理，包括液液萃取[21]–[25]、固相萃取[22]–[30]或蛋白质沉淀[23]等步骤，每个样本的总处理时间通常超过30分钟。更为关键的是，大约每150–200份临床唾液样本中就有一份的样本量低于50微升[26]，这就需要重新采集样本，给患者和临床工作带来额外负担。这些因素限制了该技术在紧急或偏远地区的应用[31]、[32]。对于那些本身就难以产生足够唾液的群体，如幼儿、老年人以及因药物或疾病导致口干症的患者而言，重复采集样本更为困难，样本量要求更是成为诊断的障碍。如果能有一种方法能在极少样本量的情况下快速定量皮质酮，且无需复杂的样本处理流程，将极大提升该技术的临床应用价值。

纸喷雾电离质谱技术是一种环境电离技术，无需复杂的前处理即可直接分析少量生物样本[33]–[38]，并且已在多种生物流体和环境样本中展现出应用潜力[39]–[50]。不过，由于缺乏样本净化和色谱分离步骤，生物流体中的盐分、蛋白质和黏蛋白等基质成分会降低电离效率，进而影响定量的重复性和检测限，尤其是在检测微量物质时[51]–[53]。即便在采用纸喷雾电离质谱技术之前对生物样本进行简单的去蛋白处理和稀释，其基质干扰仍会比UHPLC-MS/MS技术更为严重[54]。

自2010年刘等人首次提出这一技术以来[55]，纸喷雾电离技术已发展成一种概念简单、成本较低的现场质谱分析方法，其在即时检测领域的应用也越来越广泛[37]–[57]。随着研究深入，人们开发出了各种类型的载体，包括疏水性载体[39]、[58]和硅胶涂层载体[59]，以及具有特定功能化的载体[60]、[61]、不同种类的纸张[62]–[64]、蜡印通道[40]、带有集成解溶剂功能的3D打印检测盒[65]–[66]或固相萃取功能[53]、[57]、[67]、[68]，还有双电离模式[69]、纸固定化液相微萃取技术[70]、反应性处理方法[71]–[72]以及纸基电渗流分析技术[73]–[74]。商业化的产品，如Thermo Scientific公司的VeriSpray离子源[75]、[76]，进一步推动了该技术在临床领域的应用。尽管取得了这些进展，但目前仍以无需纸基分离的直接三角喷头式喷雾方式为主，而生物流体中的基质成分依然会抑制电离效率，影响分析性能。上述各种技术都表明，将样本前处理和分离步骤与纸喷雾电离技术结合，可以有效减轻复杂生物流体中的这些干扰效应[77]；不过，样本量、分析物提取和净化所需的时间以及操作的便捷性仍然是临床应用中的关键限制因素。正是出于这些考虑，人们开始研究一种将样本采集、基质排除、分析物富集和电离功能整合在同一个一次性载体上的设计。

为了解决这一矛盾，我们采用了纸箭形质谱技术。这种载体设计将基质去除和分析物富集功能直接集成在电离单元中，既保留了传统纸喷雾技术的快速、简便和低成本优点，又具备了满足临床需求的分析性能。纸箭形质谱技术属于纸喷雾电离技术的一种，它将采样、提取、分离、富集和电离过程整合在同一张纸条上。最近，已有研究将该技术用于直接从未经处理的唾液样本中定量对乙酰氨基酚，并进行了交叉验证[78]。我们团队最早提出了将箭头形状的纸载体（一种矩形色谱柱，末端为三角形喷头，毛细管驱动的溶剂流动可将分析物高度浓缩）以及基于载体的基质去除和富集原理应用于纸喷雾电离技术[52]、[78]；后来，这种箭头形状的纸载体也被用于其他检测方法，比如用于霉菌毒素分析的纸增强红外光谱技术[79]。在实际操作中，只需将少量样本施加在箭头形状载体的色谱柱部分，随后在毛细管驱动下，少量流动相会带动样本快速移动；基质干扰物会留在色谱柱中，而目标分析物则会迁移到箭头部位并在此处浓缩，最终作为电喷雾发射端。这种设计既保持了纸喷雾电离技术的简单性和快速性，又有效降低了基质干扰的影响[52]。

在本研究中，我们开发了用于测定人唾液中皮质酮含量的纸箭形串联质谱技术，并通过健康志愿者的样本对其方法可行性进行了验证。该检测方法只需将4微升样本施加在预先加载有皮质酮-d8内标物的箭头形状纸载体上，再使用200微升非卤代流动相（乙酸乙酯/甲醇，体积比9:1）进行洗脱，从而无需离线样本预处理，也能最大限度地减少有机溶剂的消耗。从样本加入到得出检测结果的时间不超过10分钟。该方法的设计遵循ICH M10生物分析指南[80]，并且我们在7名健康志愿者的28份样本中将该方法与UHPLC-MS/MS技术进行了交叉验证。据我们所知，这是首次将纸箭形质谱技术应用于痕量内源性生物标志物的检测。

2. 实验部分

2.1 化学试剂与材料
皮质酮（甲醇溶液，浓度1毫克/毫升）、皮质酮-d8（纯度≥98%）、HPLC级溶剂（纯度≥99.7%），包括乙酸乙酯、2-丙醇和甲醇，以及Whatman 1级色谱纸（25毫米尺寸），均购自Sigma Aldrich公司（美国密苏里州圣路易斯市）。甲酸铵（纯度99%）购自Fisher Scientific公司（英国拉夫堡）。超纯水则由Milli-Q Advantage A10系统（美国马萨诸塞州米尔皮尔公司）制备。

2.2 标准溶液的制备
将皮质酮储备液（浓度1毫克/毫升）用磷酸盐缓冲液稀释，得到浓度分别为0、0.2、0.5、1、2、5、10、25、50和100纳克/毫升的工作溶液；经验证，该方法的定量范围为0.5–50纳克/毫升。皮质酮-d8内标储备液（甲醇溶液，浓度1毫克/毫升）则用甲醇稀释至20纳克/毫升，用于纸箭形质谱分析。所有溶液均需涡旋混合30秒，然后储存在-20摄氏度条件下待用。

2.3 纸载体的制备
我们使用数字模板（见图S1）和40瓦特激光切割机（HPC Laser Ltd，英国），以20%的切割速度和13%的功率，将Whatman 1级色谱纸激光切割成三角形载体（底边长度11毫米，高度11毫米），用于纸喷雾电离串联质谱分析；同时切割出箭头形载体，用于纸箭形质谱分析。每个箭头形载体由一个矩形色谱柱部分（尺寸5毫米×35毫米）和一个等腰三角形喷头部分（底边长度11毫米，高度11毫米）组成。这些载体首先在水中超声清洗5分钟，然后在甲醇中超声清洗5分钟，最后在常温下晾干过夜。

2.4 优化后的纸箭形质谱/串联质谱分析流程
将皮质酮-d8内标溶液（4微升，浓度20纳克/毫升，溶剂为甲醇）滴加在箭头形载体上，位置位于喷头下方10毫米处，然后在室温下干燥30秒。接着将4微升样本滴加在同一位置，同样在室温下干燥30秒。之后将箭头形载体沿其中心轴折叠，竖直放入装有200微升流动相（乙酸乙酯/甲醇，体积比9:1）的20毫升琥珀色试管中。在毛细管驱动作用下，溶剂会流动5分钟，直到溶剂前沿到达箭头喷头部位。干燥处理完成后（至少30秒），取出三角形喷头部分，用于质谱分析。

为了产生电喷雾，我们在三角形载体的底部安装了一个镍制夹子，用于建立电气连接，该夹子的顶端距离质谱仪进样口4毫米。通过设置仪器参数，喷雾溶剂（100%甲醇，其中含有0.5毫摩尔/升的甲酸铵）会通过注射泵以250微升/分钟的速率在0.01–0.12分钟内自动注入载体中，总注入量为27微升。每次分析完样本后，都需要更换镍制夹子，并依次用清水和甲醇冲洗，然后晾干后再重复使用。在每天的质谱分析结束后，需要用50%的甲醇水溶液以20微升/分钟的速率冲洗质谱仪至少15分钟，以确保仪器得到彻底清洁。

2.5 纸箭形质谱/串联质谱分析的质谱参数
分析是在Thermo Scientific公司的Orbitrap Exploris 240质谱仪上进行的，分析模式为负离子模式，喷雾电压为-4.0千伏，离子传输管温度为320摄氏度，未使用雾化气。最优化的选择性反应监测过渡对列于表S1中。分析采用高能碰撞解离模式，每个过渡对的分辨率设定为60,000，扫描时间为0.1秒。该方法还采用了内部质量校准技术EASY-IC。在喷雾溶剂加入后0.28–0.9分钟内，系统会自动施加电压以引发电喷雾现象。每个样本的总分析时间为1分钟。在分析窗口内的代表性色谱图见图S5。峰积分及定量分析则是通过Xcalibur Quan Browser软件，根据皮质酮与皮质酮-d8的峰面积比值来进行的。

2.6 方法验证
我们使用添加了皮质酮的磷酸盐缓冲液样本，评估了方法的线性、最低检测限、检测下限以及残留效应。此外，还使用三种不同浓度皮质酮的人唾液样本，评估了该方法在日内和日间的精密度与准确度。通过皮质酮-d8来评估共喷雾唾液中的基质干扰效应，同时还将磷酸盐缓冲液中的皮质酮信号与空白水中的信号进行比较。此外，还对比了磷酸盐缓冲液校准曲线的斜率与唾液样本中标准添加法得到的斜率，以确认基质干扰没有影响定量结果的准确性。最后，还在实验室常温条件下，检测了两种不同浓度皮质酮在人唾液样本中干燥在纸箭形载体上的稳定性，检测时间为5天。完整的实验细节详见补充部分1.1。

2.7 与UHPLC-MS/MS方法的交叉验证
**参与者**：我们从利物浦大学招募了7名健康志愿者（4名男性，3名女性，平均年龄34±7.8岁）。所有参与者均签署了书面知情同意书。该研究已获得利物浦大学研究伦理委员会的批准（审批编号为14651），所有实验操作均符合《赫尔辛基宣言》的要求。

**唾液样本的采集**：参与者在采样前至少1小时不进食或饮水。在四个时间点（间隔至少2小时），通过被动收集法采集未刺激的唾液至少2分钟，然后将其吐入15毫升的离心管中。样本在-20°C下保存至少24小时，之后解冻并离心（4°C，18,407 × g，20分钟）以便分析。分别取4微升和200微升的样本进行PA-MS和UHPLC-MS/MS分析。UHPLC-MS/MS分析被广泛认为是测定皮质酮的金标准方法，且已得到充分验证[26]、[81]。方法细节见补充部分1.2.2.8。统计分析：图表和统计分析使用GraphPad Prism 8生成。组间比较采用双尾Student's t检验或带Tukey HSD事后校正的一元方差分析；p < 0.05视为有显著性意义。数据以均值±标准差表示。PA-MS分析重复六次；除非另有说明，UHPLC-MS/MS分析重复三次。3. 结果3.1. 纸箭法可去除基质干扰并增强信号强度在图1A中，使用PSI-MS/MS时，唾液中的内源性皮质酮信号被严重抑制，而PA-MS/MS则使绝对信号强度提升了约26倍。在之前关于唾液中对乙酰氨基酚的研究中，我们发现盐分是传统PSI-MS/MS方法导致信号丢失的主要原因[52]。下载：下载高分辨率图像（248KB）下载：下载全尺寸图像图1. 纸箭法中的纸层析技术可去除（A）人类唾液基质以及（B）PBS基质干扰，并利用PA-MS/MS与传统PSI-MS/MS相比，将皮质酮集中在纸尖处。n = 6。在此研究中，我们使用PBS来模拟人类唾液中的盐基质，并比较了在PBS和水环境中，使用传统纸喷雾电离法（PSI-MS/MS）与PA-MS/MS检测皮质酮的效果。在图1B中，使用PSI-MS/MS时，PBS中的皮质酮信号因盐分引起的离子抑制而被严重削弱。而PA-MS/MS则完全消除了这种基质效应：PBS中的皮质酮信号强度与纯水中的相当，这表明在色谱分离过程中能够有效分离盐基质。从机制上讲，纸箭的几何结构利用了毛细作用下的差异迁移：极性基质成分（如盐分、蛋白质、黏蛋白）会滞留在沉积区附近，而非极性分析物则随流动相向前移动到箭头处，在电喷雾之前在那里聚集。此外，与PSI-MS/MS分析水样相比，PA-MS/MS使绝对信号强度提升了144 ± 14%（p ≤ 0.0001）（图1B）。这种增强效应源于在毛细作用驱动的溶剂传输过程中，分析物在箭头处聚集，使得4微升的样本中的皮质酮集中在靠近纸尖的小区域内。综上所述，这些结果表明，纸箭法整合了一种固有的基底色谱步骤，该步骤既能去除基质干扰，又能将目标分析物集中在纸箭尖端。3.2. PA-MS/MS方法的优化我们系统地优化了影响PA-MS/MS分析物信号灵敏度的三个关键因素：喷雾溶剂、纸箭色谱步骤的流动相，以及样本与箭头基部的沉积距离。对喷雾溶剂添加剂的筛选显示，含0.5–1 mM甲酸铵的甲醇能为皮质酮甲酸加合物[M+FA-H]-（m/z 405.19→329.18）在负离子模式下产生最佳的信号强度（图S2A）。纯甲醇的表现优于水-甲醇混合物（图S2B），而且甲醇产生的信号也强于2-丙醇（图S2C）。最终选择的喷雾溶剂为含有0.5 mM甲酸铵的100%甲醇。喷雾溶剂的体积固定为27微升，这一数值既足以完全润湿三角形基底，又不会因样本稀释而降低信号强度。溶剂会自动喷洒在纸上，以确保结果的重复性并减少操作劳动量。对于纸箭色谱步骤的流动相，乙酸乙酯/甲醇（9:1，体积比）能在将皮质酮输送到箭头的同时，让基质成分留在色谱柱主体中（图S3A）。将样本沉积在箭头下方10毫米处，可在确保分析物有效迁移的同时，避免基质扩散到箭头区域（图S3B）。使用200微升的流动相体积，而非400微升，就能在5分钟内完成完全分离，且溶剂消耗量最少（图S3C–D）。施加在纸箭上的样本最大体积为4微升。超过4微升的体积会增加在纸层析之前基质扩散到箭头的风险，从而导致基质无法完全留在色谱柱主体中，反而向箭头方向迁移。如果需要更大的样本体积来提高信号灵敏度，则应相应增加样本与箭头基部的沉积距离。3.3. 方法验证高分辨率UHPLC-QTOF-MS/MS检测结果显示，皮质酮和皮质酮-d8标准溶液不存在污染物，且在唾液采集管、纸基底或提取溶剂中均未检测到这两种化合物。在人类唾液样本中测得的定性离子与定量离子的比值在校准标准的±20%范围内，这表明不存在同位素干扰问题。在PBS介质中建立的校准曲线在0.5–50 ng/mL范围内具有极好的线性度（R2 = 0.9990，图2）。由于唾液是一种更为复杂的生物基质，其中含有脂质等非极性代谢物以及其他可能干扰检测的成分，这些成分会随样本一同被喷射到纸箭尖端并与皮质酮一起被检测到，因此我们比较了PBS校准曲线的斜率与在混合唾液样本（内源性皮质酮浓度为1.52 ng/mL）中进行标准添加实验所得到的斜率，以此验证基于PBS的定量方法的适用性。如图2所示，两条曲线基本平行，斜率之间没有统计学上的显著差异（PBS：0.8302；唾液：0.8288；p = 0.8372）。鉴于未检测到显著的唾液基质效应，后续的PA-MS/MS定量分析便采用了PBS校准曲线。该方法的定量下限为0.5 ng/mL，此时检测结果的偏差在0.5%到15.6%之间；而在其他所有浓度下，检测结果的准确度（偏差）均在±12.8%范围内。检测下限为0.13 ng/mL（实验测得值为0.15 ng/mL）。在对处于定量下限、上限以及空白PBS样本进行十次连续分析后，发现皮质酮的残留率为4.3 ± 2.9%（相对于定量下限的响应值），而皮质酮-d8的残留率为0.07 ± 0.03%（相对于工作浓度值），这两者均低于分别小于20%和小于5%的接受标准（表S3）。下载：下载高分辨率图像（270KB）下载：下载全尺寸图像图2. 为验证基于PBS的定量方法的适用性，通过PA-MS/MS在PBS介质和混合人类唾液样本中检测不同浓度的添加皮质酮（0.5–50 ng/mL）所获得的校准曲线。每种浓度下重复检测6次。在定量下限（PBS中的0.5 ng/mL）时，该方法的单日精确度和日间精确度分别为8.4%和7.3%的相对标准偏差（表1）。对于人类唾液中的内源性皮质酮，其在低、中、高浓度下的单日精确度分别在4.2%到6.6%的相对标准偏差范围内，日间精确度则在5.2%到6.2%的相对标准偏差范围内，均符合≤15%的接受标准。在浓度为1.1 ng/mL的内源性皮质酮的混合人类唾液样本中，分别添加1.5、5和20 ng/mL的皮质酮后，其单日准确度在96%到105%之间，日间准确度在97%到101%之间，也在85%到115%的接受范围内。表1. 在PBS中的定量下限以及人类唾液中的低、中、高浓度下，PA-MS/MS方法用于皮质酮定量时的单日精确度和日间精确度。基质浓度水平单日精确度（n = 10）日间精确度（n = 6 / 天，共3天）均值±标准差（ng/mL）相对标准偏差均值±标准差（ng/mL）相对标准偏差PBS0.5（定量下限）0.50 ± 0.048.4%0.52 ± 0.047.3%人类唾液低浓度1.82 ± 0.126.6%1.82 ± 0.115.9%中浓度5.32 ± 0.356.6%5.46 ± 0.346.2%高浓度12.3 ± 0.524.2%12.4 ± 0.645.2%表2. 通过在浓度为1.5、5和20 ng/mL的混合人类唾液样本中添加标准物质，评估PA-MS/MS方法的单日准确度和日间准确度。添加量（ng/mL）内源性皮质酮+添加量（ng/mL）计算出的添加量（ng/mL）准确度（回收率，%）均值±标准差相对标准偏差均值相对标准偏差均值相对标准偏差单日（n = 10）01.16 ± 0.098.2%----1.52.68 ± 0.114.3%1.52 ± 0.117.5%105 ± 7.6%7.3%56.11 ± 0.487.9%4.96 ± 0.489.7%99 ± 9.6 %9.7%2021.6 ± 1.88.3%20.5 ± 1.88.7%96 ± 8.9%9.3%日间（n = 6 / 天，共3天）01.13 ± 0.098.0%----1.52.59 ± 0.145.2%1.46 ± 0.149.2%97 ± 9.0%9.2%56.19 ± 0.416.7%5.06 ± 0.418.2%101 ± 8.3%8.2%2021.8 ± 1.35.80%20.7 ± 1.36.2%98 ± 6.4%6.5%通过比较六份独立的人类唾液样本（内源性皮质酮浓度为1.7–12.4 ng/mL）中的皮质酮-d8响应值与纯水的响应值，来评估基质效应。PBS对皮质酮的基质效应为102 ± 14.6%（见图3A），在1.5 ng/mL和20 ng/mL浓度下，峰面积的相对标准偏差分别为13.2%和15.9%。而对于六份不同个体来源的唾液样本，皮质酮-d8的基质效应为102 ± 6.9%（图3B），在低浓度和高浓度下，不同样本间的峰面积变异系数分别为7.2%和3.8%。这些数值表明，在经过纸箭色谱分离后，不存在显著的系统性离子抑制或增强现象。下载：下载高分辨率图像（317KB）下载：下载全尺寸图像图3. 对PA-MS/MS方法的基质效应进行评估。将(A)PBS中的皮质酮以及(B)六份人类唾液样本中的皮质酮-d8的峰面积与纯水的峰面积进行比较。n = 6。为了模拟通过常规邮政服务运输样本的情况，我们在室温（20–25 °C）下评估了皮质酮在纸箭基底上的稳定性，测试时长为5天。在第0天就加入内标物的三组唾液样本（含内源性皮质酮以及浓度为1.5和20 ng/mL的添加皮质酮的样本），在储存5天后，其浓度与设定值之间的平均偏差小于5%（图4，第一组）。而在第5天才加入内标物的那些样本（用于单独评估分析物的降解情况），其浓度与新鲜制备的样本相比，偏差也小于10%（图4，第二组）。没有任何一份样本的浓度偏差超过14%，且所有样本的相对标准偏差都低于8.5%。这5天的室温存储时间与常规邮政投递的时间范围相符，因此支持通过邮件发送样本进行分析的可行性；不过，此处并未评估在实际运输过程中可能出现的极端温度和湿度条件下的样品稳定性（详见“局限性”部分）。下载：下载高分辨率图像（307KB）下载：下载全尺寸图像图4. 在进行PA-MS/MS分析之前，皮质酮在纸箭基底上的室温稳定性测试，测试时长为5天。第一组：在第0天加入内标物；第二组：在第5天加入内标物。虚线表示±15%的接受范围。n = 6。3.4. 与UHPLC-MS/MS的交叉验证为确立该方法的临床有效性，我们使用了从7名健康志愿者那里收集的、在28个不同时间点采集的唾液样本，将PA-MS/MS定量方法与经过验证的UHPLC-MS/MS参考方法进行了比较。图S4和图S5分别展示了具有代表性的UHPLC-MS/MS和PA-MS/MS色谱图。PA-MS/MS与UHPLC-MS/MS之间的皮尔逊相关系数为0.9944，林氏一致性相关系数为0.9938（图5A）。布兰德-阿尔特曼分析显示，两者之间的平均差异为4.17 ± 6.98%，95%的共识区间为-9.51%到+17.84%（图5B）。这样的吻合程度表明，PA-MS/MS方法具备与金标准色谱方法相当的定量精度，而且由于采用了简单的纸质分析方法，所需的样本量仅为后者的一半。下载：下载高分辨率图像（278KB）下载：下载全尺寸图像图5. 通过UHPLC-MS/MS对PA-MS/MS方法进行交叉验证，用于测定唾液中的皮质酮含量。（A）相关性图表。（B）布兰德-阿尔特曼图，显示了平均百分比差异（偏差）以及95%的共识区间（蓝色实线）。共有来自7名志愿者的28份样本。4. 讨论我们在此首次报道了一种基于环境条件下质谱技术的分析方法，该方法能够实现与UHPLC-MS/MS同等精度的健康人类唾液中的内源性类固醇生物标志物的定量分析。该方法的创新之处在于它采用了临床适用的4微升唾液微量采样方案，这使得能够快速、简便且经过充分验证地测定0.5 - 50 ng/mL范围内的皮质酮浓度，非常适合那些对样本量、患者舒适度以及分析速度有较高要求的实际临床检测场景。此前的纸箭法主要用于检测浓度为微克每毫升的外源药物，比如唾液中的对乙酰氨基酚[78]，而本研究中的方法则能检测浓度低两个到三个数量级的内源性类固醇，即亚纳克到纳克每毫升级别的物质，而且还采用了负离子模式下的甲酸加合物检测方式，从而大大扩展了该分析技术的应用范围。PA-MS平台解决了唾液类固醇分析中的一个关键实际问题：临床上倾向于采用微量采样，但这与传统色谱方法所需的较大样本量之间存在矛盾。通过将提取、基质分离、分析物富集以及离子化过程整合在同一张纸基底上，PA-MS方法仅需4微升的唾液样本即可实现皮质酮的定量分析，即便是对口干症患者、儿童或那些无法产生足够量的静止期唾液以用于传统检测方法的患者来说，这个样本量也是容易获取的。这种微量采样能力具有直接的临床意义：大约每150–200份临床唾液样本中就有一份的样本量低于50微升[26]，因此需要反复让患者重新采集样本，这无疑会给患者和临床工作带来负担。除了微量采样的优势之外，纸质基底以及较低的溶剂需求也是PA-MS方法区别于现有分析技术的特点。表3总结了与临床应用唾液皮质酮检测相关的PA-MS方法的分析性能及实际应用优势。例如，PA-MS方法的成本极为低廉，每张纸质基底的成本不到0.03英镑，有机溶剂的消耗成本则更低，不到0.02英镑。此外，该方法无需任何特殊的制备步骤，比如表面化学改性处理。完整的分析过程仅需200微升的非卤化流动相和27微升的喷雾溶剂，这与许多薄层色谱法和液液萃取法中使用的卤化溶剂（如氯仿、二氯甲烷）相比，可降低溶剂废弃物处理成本[82]。产生的废弃物极少。纸基载体上的有机溶剂残留物（乙酸乙酯/甲醇，9:1）在室温下30秒内即可蒸发，而溶剂瓶中剩余的流动相还可重复使用。相比之下，已发表的用于检测唾液皮质酮的UHPLC-MS/MS方法通常需要50–250微升的唾液以及更多量的溶剂，还会产生大量有机废弃物。例如，Raff等人每个样本需要50微升唾液和2毫升叔丁基甲基醚[18]，而另一种方法（检测限为0.01纳克/毫升）则需要250微升唾液、溶剂萃取、1小时的衍生化处理以及在线固相萃取，耗用的有机溶剂超过1.5毫升[24]。PA-MS的10分钟出结果速度远远优于需要30–60分钟的UHPLC-MS/MS方法。表3列出了与唾液皮质酮定量临床应用相关的分析及实际因素，以及相应的PA-MS性能表现。

**分析及实际方面**
**PA-MS性能**
精度、准确度与重复性：具有出色的日内及日间精密度（相对标准偏差≤8.4%）和准确度（96–105%）（表1）。
分析物富集与预浓缩：毛细管驱动的迁移作用能使分析物在箭头位置富集，从而使信号灵敏度提高144%（图1），且无需增加样本量；这一优势是纸基固相萃取或选择性捕获等其他方法所不具备的。
基质效应与离子抑制：能有效去除载体上的基质成分（包括脱盐处理）：在磷酸盐缓冲液以及六名不同捐赠者的唾液中均未观察到显著基质效应，完全符合ICH M10标准[80]。
携带效应与污染：一次性纸基载体可避免样本间的携带效应（表S3）；载体上的基质去除措施还能进一步减少对质谱仪进样的污染。
内部标准策略：内部标准在制造过程中就已加载到纸基载体上，无需在分析时手动移取，简化了操作流程。
灵敏度与临床意义：检测限为0.5纳克/毫升，远低于肾上腺功能不全和库欣病筛查中唾液皮质酮的诊断阈值（表S4）。
样本量与处理：所需样本量极小：每次检测仅需4微升唾液，已有研究证明2微升也可实现检测[78]。样本可直接进行分析；冷冻样本则需遵循所有唾液检测通用的解冻混合流程。
通量与周转时间：从样本处理到得出结果仅需不到10分钟（溶剂传输快速，色谱发展时间≤5分钟，喷雾采集时间<1分钟）。双箭头结构使得一次检测即可同时进行重复分析，而最多10个载体的并行色谱发展则有利于未来实现大规模临床检测。
耗材成本：每次检测的总耗材成本低于0.05英镑（纸基载体成本低于0.03英镑，约227微升的HPLC级溶剂成本低于0.02英镑）。所有可重复使用的部件（金属接触件、溶剂容器）只需常规冲洗，无需特殊再生步骤。
操作的健康与安全：采用了非卤化溶剂和添加剂，替代了薄层色谱法和液液萃取法中常用的卤化溶剂。在质谱仪进样口处需采取标准的高压防护措施。由于溶剂用量少（≤200微升）且化学性质温和，纸色谱分析可在简单的封闭式发展室中进行，无需专用通风橱，这为未来开发适用于基层医疗场所的一次性独立检测盒奠定了基础。
设置与使用的便捷性：操作极为简单：纸色谱分析仅需要一个密封的发展容器，离子化则可使用标准的PSI-MS离子源。无需特殊仪器、微流控检测盒或专用耗材，因此该分析流程可轻松应用于现有的临床质谱实验室。
废弃物产生量：极少：每次检测仅需一个纸基载体和≤200微升的非卤化溶剂，这些废弃物均可与常规临床实验室的废弃物一起处理。
即时检测的适用性：由于样本前处理简单、溶剂消耗低，且从样本处理到出结果的时间不足10分钟，PA-MS有望未来被应用于便携式质谱仪上的即时皮质酮检测，其应用范围可涵盖内分泌科、急诊科以及基层诊断机构。
其0.5纳克/毫升的检测限虽然低于某些UHPLC-MS/MS方法所报告的唾液皮质酮最低检测值——那些方法的检测限可达到皮克/毫升级别[22]、[23]、[24]——但已足以满足当前临床需求：该检测限远低于库欣病筛查的诊断阈值（1.3–16.9纳克/毫升）[1]、[83]以及肾上腺功能不全的诊断阈值（<2.5纳克/毫升）[6]（表S4）。重要的是，这种灵敏度可直接通过4微升唾液实现，无需依赖那些最敏感的方法所必需的离线萃取、衍生化或预浓缩步骤。对于浓度仅为纳克/毫升级的唾液皮质酮而言，这些方法更高的灵敏度并无诊断必要性；临床决策更为关键的是准确性，而在这方面PA-MS的结果与UHPLC-MS/MS的结果十分接近（图5）。
分析皮质酮时首选静息状态下的唾液，因为通过咀嚼口香糖、棉签或柠檬酸等方式刺激唾液分泌，会使唾液中的皮质酮浓度下降25–35%，这很可能是由于快速流动的唾液中的11β-HSD2酶加速了皮质酮的转化[84]。此外，刺激方法有时会给患者带来不适，尤其是棉签带来的难闻味道和口腔干燥感[78]。PA-MS对样本量要求较低，因此可通过被动收集唾液来避免这些干扰因素，同时还能降低成本并减轻患者负担。
对于环境电离分析法而言，一个重要的分析考量因素是在缺乏仪器色谱分离条件时的选择性问题。对于唾液皮质醇而言，这是个重大挑战：我们的UHPLC-MS/MS分析方法检测到了至少两种内源性异构体，很可能是20α-和20β-二氢皮质酮[85]，它们与皮质醇在色谱图中几乎同时出现，且具有相同的特征碎片离子（m/z 363.22→163.12，与Tokarz等人的研究结果一致[86]；在图S4中标记为化合物1和2）。通常用作皮质醇定量指标的次要碎片离子m/z 363.22→121.07，在缺乏色谱分离能力的环境电离分析中会导致皮质醇浓度被高估。而皮质酮则未出现此类干扰现象；所有分析的唾液样本在所有监测的质谱跃迁中都只出现一个清晰的分离峰（图S4）。这种分析选择性，再加上唾液皮质酮与血清游离皮质醇之间的相关性比唾液皮质酮本身与血清游离皮质醇的相关性更强，这些都使得皮质酮成为环境电离分析平台的理想生物标志物。
研究表明，干燥后的唾液在纸箭头载体上可保持5天的稳定性，这为一种基层检测模式提供了可能——即患者可在家中采集唾液，包括对库欣病筛查至关重要的深夜采集的样本，然后通过普通邮递方式寄回，无需冷链运输。在现实世界的运输温度和湿度条件下进行方法验证仍是未来的工作内容（见局限性部分）。

**5. 局限性与未来发展方向**
目前的研究已通过ICH M10生物分析验证标准[80]以及对健康人群进行的UHPLC-MS/MS交叉验证，证明了PA-MS的分析有效性。要将其应用于常规临床检测，还需在三个方面进一步评估。首先，必须在患者群体中验证其诊断性能。PA-MS的校准范围为0.5–50纳克/毫升，旨在覆盖与库欣病和肾上腺功能不全相关的唾液皮质酮浓度范围；接下来需要招募疑似或确诊患有内分泌疾病的患者，针对临床参考标准确定该方法的诊断灵敏度和特异性，并分析这些患者群体中常见的药物及其结构相似代谢物可能带来的干扰。我们正通过现有的内分泌学合作项目计划开展前瞻性患者研究。
其次，实际应用时需要系统地评估该方法的技术稳定性，包括不同批次载体之间的 consistency、不同操作人员之间的差异，以及环境温度和湿度对毛细管发展过程的影响。目前已证明该方法在常温环境下可保持5天的稳定性，这为一种基层检测模式提供了可能——即患者可在家中于深夜采集唾液样本，然后通过邮递寄回；在包括温暖潮湿气候在内的现实世界邮递条件下对该检测流程进行验证是接下来的合理步骤。这一预期与干血斑类固醇检测的结果一致：尽管皮质酮属于较为易受温度影响的肾上腺类固醇，但在室温下其在干燥的纤维素载体上仍可保持约两周的稳定性，而在较高温度下则会更快降解[88]。
第三，PA-MS由于样本处理量少、溶剂消耗低，且分析时间不足10分钟，非常适合与便携式质谱仪结合使用。这样的整合有望在内分泌科病房实现即时皮质酮检测，从而加快诊断速度；在急诊科，快速识别肾上腺危机（这是一种可能危及生命的状况，需要立即补充类固醇）也至关重要。除了皮质酮之外，同样的纸箭头分析架构还可扩展用于更广泛的体内类固醇检测，从而实现床边多参数肾上腺轴功能检测。

**6. 结论**
我们首次报道了一种基于环境电离质谱的方法，该方法能够实现对人类唾液中有内源性类固醇生物标志物的检测，其检测精度可与UHPLC-MS/MS方法相当。纸箭头质谱法只需4微升唾液，10分钟内即可完成唾液皮质酮的定量分析，检测限为0.5纳克/毫升，精密度为相对标准偏差≤8.4%，准确度为96–105%，且几乎没有基质效应、携带效应以及内源性干扰。该方法已通过ICH M10生物分析标准进行充分验证，与UHPLC-MS/MS方法的对比结果显示，在临床相关范围内两者结果高度一致（Lin一致性系数为0.994，平均差异为4.17 ± 6.98%）。
除分析性能外，PA-MS还解决了若干与临床应用相关的实际问题。由于样本量减少了50倍，因此那些无法提供传统检测方法所需样本量的患者，如儿童、老年人以及口干症患者，也能接受可靠的检测。在常规实验室环境条件下，干燥后的样本在纸箭头载体上可保持5天的稳定性，这为基层采样和邮递送检提供了可能；在现实世界的运输条件下的验证仍是未来的工作内容。综上所述，PA-MS为唾液皮质酮的微量检测提供了一种基于环境电离质谱的分析平台，对于那些以往难以通过色谱法进行检测的群体而言，具有巨大的应用潜力。我们正在继续开展相关工作，将该分析平台扩展用于更广泛的类固醇检测，以及肾上腺疾病患者群体的检测，最终目标是实现床边内分泌疾病的即时检测。

**作者贡献说明**
Tung-Ting Sham：撰写原文初稿、数据可视化、方法学研究、项目管理、数据整理。Yufeng Zhou：撰写文章的审阅与编辑工作、资源准备、方法学研究。Barry Smith：撰写文章的审阅与编辑工作、资金筹集工作。Joanne C. Blair：撰写文章的审阅与编辑工作、资金筹集工作、概念设计。Simon Maher：撰写文章的审阅与编辑工作、实验指导、方法学研究、资金筹集工作、概念设计。

**数据可用性**
本研究的相关数据可应要求提供。

**利益冲突声明**
作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。