DNN-PURE：基于深度神经网络的纸质尿素检测方法

《Biosensors and Bioelectronics》：DNN-PURE: A Deep Neural Network Approach to Paper-based Urea Sensing

　　苏维克·比斯瓦斯|阿里吉特·帕尔|科尔·乔杜里|索门·达斯印度西孟加拉邦卡拉格普尔印度理工学院医学科学与技术学院，邮编721302摘要本研究开发了一种低成本、可丢弃的纸质酶传感器，用于定量检测血清样本中的尿素浓度。该传感器采用一种新的检测机制，通过检测局部感应区域内的离子传导情况来测量阻抗变化，从而实现高灵敏度的检测。该感应平台是通过在色谱纸基底上功能化聚苯胺制成的，这不仅提高了电导率，还使得通过戊二醛交联将脲酶共价固定成为可能。此外，通过扫描电子显微镜、拉曼光谱和X射线光电子能谱对材料进行表征，证实了聚苯胺的成功沉积以及酶的固定效果。阻抗特性分析显示，该传感器具有很高的灵敏度，其临床检测范围为0.01毫克/毫升至1毫克/毫升，检测下限为0.01毫克/毫升（0.166毫摩尔/升），灵敏度为每毫克/毫升6.977个标准化阻抗变化单位，分辨率可达0.04毫克/毫升。为进一步提升分辨率并减少人为误差，研究人员采用了深度神经网络回归模型，该模型以四个关键频率（100赫兹、1千克赫兹、10千克赫兹和100千克赫兹）下记录的阻抗响应数据作为训练依据。该深度神经网络模型展现出出色的预测能力，准确率超过98%，远优于传统的手动校准方法（94.71%），且分辨率提升到了0.02毫克/毫升。通过布兰德-阿尔特曼分析验证了该感应平台的稳定性，而加标血清样本的测试则证明了该传感器在真实生物环境中的有效性。此外，该传感器还经过临床样本测试，以验证其在实际应用中的性能。深度学习的引入不仅提升了检测的精确度和分辨率，还实现了尿素的自动化实时定量分析，使得这一感应平台有望应用于即时诊断和生物医学领域。引言血液血清中尿素的定量检测对于诊断和监测与肾功能及代谢平衡相关的疾病至关重要。尿素是蛋白质代谢的主要终产物，由肝脏合成后由肾脏排出，因此它是评估肾脏和肝脏健康以及整体代谢状况的可靠生物标志物。通常以血尿素氮的形式进行检测，其水平升高表明存在肾功能障碍，因为受损的肾脏无法有效清除代谢废物。慢性肾病、急性肾损伤以及其他肾脏疾病都会显著提高血清尿素水平，使其成为重要的诊断指标。此外，较高的血尿素氮水平还与较高的心血管风险相关，包括中风和急性缺血性中风患者的死亡率。相反，尿素水平过低则可能提示存在肝脏功能障碍、营养不良或遗传性尿素循环酶缺乏症，这些情况都会影响氮的代谢。因此，监测血清尿素水平对于早期干预非常重要，尤其是对于那些需要接受透析治疗或患有慢性代谢疾病的患者。目前已有多种尿素检测定量方法，包括核磁共振、红外光谱、高效液相色谱和气相色谱等。然而，这些方法都需要专业操作人员以及昂贵的仪器，不适合在即时检测场景中使用。开发快速、灵敏且成本较低的检测方法，能够显著提升即时检测以及资源匮乏环境下的患者护理水平。对于成本效益高的即时检测而言，基底的选择至关重要。纸张因其低成本、易获取、可生物降解以及易于处理等优点，已成为一种极具潜力的选择，非常适合用于便携式、可丢弃的诊断设备。不过，酶往往通过弱而非特异性的非共价相互作用吸附在纸张上，这会降低酶的稳定性和活性，进而影响传感器的可靠性和重复性。共价固定酶则是一种更为有效的替代方案，它能够提升传感器的稳定性和灵敏度，但同时需要在保持生物活性的前提下对基底进行功能化处理。聚苯胺非常适合用于这一目的：它出色的电导率有助于提升电化学传感性能，其表面的游离胺基则可作为共价固定酶的活性位点，从而提升传感器的耐用性和信号传输效率。将聚苯胺与纸张结合使用，可以制造出价格低廉、性能可靠的传感器，这类传感器对多种生物分子都具有高灵敏度和高特异性。由于操作简便，循环伏安法、差分脉冲伏安法和计时安培法等电化学技术被广泛用于尿素检测。不过，电阻抗谱技术则能提供更出色的分析效果，它具有更强的抗表面污染、抗环境光干扰以及抗氧化还原活性物质的能力。通过在不同频率范围内施加交流信号，电阻抗谱技术能够量化界面电容、寄生电容以及电子传递阻力，从而为传感器优化和性能评估提供可靠的依据。本研究利用电阻抗谱技术，研究了尿素与经酶功能化处理的聚苯胺涂层纸张基底之间的相互作用。该传感器的工作原理基于感应区域内的局部离子传导现象，这是一种不同于传统脲酶固定纸质检测方法的创新思路。整个制作过程都经过了系统的监控，并通过阻抗响应数据进行了验证，以确保结果的重复性。扫描电子显微镜和X射线光电子能谱分析证实了聚苯胺的成功功能化处理，而拉曼光谱则证明了脲酶已共价结合在聚苯胺纳米纤维上。该传感器能够在0.01–1毫克/毫升的临床重要范围内检测尿素，研究人员还提出了一种新的等效电路模型，用以解释不同浓度下阻抗的变化规律。针对潜在的干扰生物分子进行的特异性测试表明，该传感器能够特异性地响应尿素，这为其在复杂的生物基质中的应用提供了有力支持。基于深度神经网络的回归模型实现了检测结果的自动解读，它能够准确预测加标血清样本中的尿素浓度，进而提升传感器的分辨率，显示出其在自动化诊断流程中的巨大潜力。与近期研发的其它纸质尿素传感器相比，该传感器的灵敏度、特异性以及实用性均有所提升。这项研究首次展示了基于聚苯胺和脲酶功能的电阻抗纸质生物传感器在尿素定量检测方面的概念验证，并通过真实的人类血清样本测试证明了其在临床应用中的可行性。该传感器的检测原理基于酶介导的尿素检测，通过电阻抗谱技术来监测局部离子传导和界面电荷传输的变化。此外，基于阻抗响应数据的深度神经网络回归框架进一步提升了检测的准确性和分辨率。材料与方法有关传感器制作的材料及试剂的详细信息详见补充附录SA的第1.1节。补充附录SA的第1.2节介绍了聚苯胺涂层纸质尿素传感器的制作流程，其中包括结构示意图、设备照片、实验设置以及样品量的优化方案。用于分析传感器形态、结构及表面化学性质的表征技术扫描电子显微镜分析通过扫描电子显微镜图像分析了未经过处理以及经过聚苯胺改性的纸张基底的表面形态。图1(a)展示了纤维素纤维的纤维状结构。从图1(b)可以看出，聚苯胺在纤维素纤维上形成了均匀的沉积层。聚苯胺沉积后，纤维素基质的完整性依然保持良好，这一点在图1(b)中也有明显体现。这两张图像都是以15KX的放大倍率拍摄的。聚苯胺改性后的元素分布情况通过……深度神经网络辅助的尿素检测随着不同尿素浓度作用后阻抗的逐渐下降，表明系统的导电性得到了提升。这些阻抗数值被用来构建一个可靠的深度神经网络回归模型，该模型使用Python语言和TensorFlow库来实现。最初，这些阻抗响应数据被处理成特征矩阵。这些数据包含12种不同的尿素浓度，每种浓度对应30个阻抗数据点以及5次测量值。检测机制该传感器的工作原理基于两个银电极之间的电子传导，电流流动情况会受到聚苯胺基质不同改性状态的影响。未经改性的聚苯胺基质具有最高的导电性，如图4(e)所示，其阻抗测量值被作为基准值（即干态基准值）。随后，通过加入2微升1%的戊二醛溶液，对聚苯胺基质进行改性处理。真实样本分析该传感器通过了来自卡拉格普尔BC罗伊技术医院的真实血清样本的验证。如表S6所示，基于深度神经网络的纸质尿素传感器的平均准确率为98.48%，标准差为3.37%，相对标准偏差为3.38%。补充信息中的图S8展示了标准化后的光谱图，插图中还提供了所使用的传感器照片。成功的血清样本分析结果证明，该传感器在含有蛋白质的复杂生物基质中也能正常工作。结论本研究成功开发了一种成本低廉、经过聚苯胺功能化处理的纸质电阻抗传感器，可用于定量检测血清样本中的尿素。该传感器的设计采用了戊二醛作为共价固定酶的载体，这一策略提升了脲酶的稳定性和活性。对该传感器的阻抗响应进行了全面的功能分析和研究，结果表明它具有极高的灵敏度、特异性以及重复性。ACRediT作者贡献声明阿里吉特·帕尔：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，方法学，研究，正式分析，数据整理，概念构思。科尔·乔杜里：写作——审阅与编辑，监督，项目管理，资金筹集。索门·达斯：写作——审阅与编辑，监督，资源协调，项目管理，资金筹集。苏维克·比斯瓦斯：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，方法学，正式分析。未引用参考文献陈等人，2024年。利益冲突声明作者声明自己不存在任何可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。资金来源本项目得到了印度医学研究委员会的慷慨资助，项目代码为PUC（资助编号R.11017/13/2023-GIA/HR）。利益冲突声明? 作者声明自己不存在任何可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。致谢作者衷心感谢纳米科学与技术学院提供的拉曼光谱分析设施。同时，也感谢印度医学研究委员会-DHR的慷慨资金支持。此外，作者还要感谢印度理工学院卡拉格普尔分校的中心研究设施，感谢他们在X射线光电子能谱和能量色散X射线光谱测量方面给予的帮助。