负载神经干细胞(NSC)的硬脑膜细胞外基质(ECM)水凝胶改善小鼠创伤性脑损伤(TBI)后的功能恢复

《ACS Biomaterials Science & Engineering》：A Dural Extracellular Matrix Hydrogel with Neural Stem Cells Improves Recovery from Traumatic Brain Injury in Mice

　　

目前创伤性脑损伤(TBI)限制永久性组织损伤及继发损伤的临床治疗方案仍不理想。神经干细胞(NSC)脑实质内移植是通过替代和/或保护受损细胞治疗TBI的潜在手段，将干细胞包埋于促再生水凝胶中可使其滞留于移植部位并调节炎症反应。本研究报道了一种猪硬脑膜来源的脱细胞细胞外基质(ECM)水凝胶并评估其体外及体内疗效。体外实验显示，硬脑膜ECM水凝胶可减轻缺氧条件下星形胶质细胞的氧化应激，并影响成纤维细胞来源基质的胶原重塑。蛋白质组学分析表明硬脑膜ECM含559种蛋白质及基质结合囊泡(matrix-bound vesicles, MBVs)，且MBVs不同于传统细胞来源外泌体。体内实验中，经控制性皮质撞击致TBI小鼠在使用单纯水凝胶、悬浮NSC或二者联合治疗后，运动功能恢复均得到改善。该新型生物材料单独作为TBI治疗手段或作为细胞递送载体均具应用前景。

论文解读：负载神经干细胞(NSC)的硬脑膜细胞外基质(ECM)水凝胶改善小鼠创伤性脑损伤(TBI)后的功能恢复

本研究发表于《ACS Biomaterials Science & Engineering》。目前中重度创伤性脑损伤(TBI)是全球青壮年致死和永久性致残的首要原因，成人脑内缺乏足够的内源性神经干细胞(NSC)来补充初始冲击造成的损伤组织，且伤后抑制性微环境（继发性损伤）阻碍细胞外基质(ECM)的健康重塑，现有临床手段无法有效限制继发性损伤及TBI对生活质量的长远影响。NSC脑实质内移植可辅助TBI后运动及认知恢复，机制可能涉及细胞替代、NSC的神经保护作用及其对脑源性神经营养因子的调控；将NSC载入基质中以将其保留在移植部位可进一步增强疗效，但合成材料缺乏生物活性。组织特异性脱细胞ECM因保留结构蛋白、糖胺聚糖(GAGs)、生长因子及基质结合囊泡(MBVs)等生物活性分子而具促再生潜力，猪脑ECM虽在TBI及脊髓损伤模型中有效但因脑组织高细胞密度和高含水量导致产量低，而硬脑膜(dura mater)作为包裹脑和脊髓的保护层已有脱细胞后用于鼓膜修补、脊髓损伤及硬脑膜移植的先例，未见硬脑膜ECM水凝胶作为细胞疗法生物活性载体用于TBI的报道。因此研究人员制备并表征了该新型硬脑膜ECM水凝胶，并在小鼠TBI模型中评估其作为NSC递送支架的潜力。

研究人员取5–6月龄猪硬脑膜组织经去垢剂–高盐–核酸酶联合处理制备脱细胞ECM粉末，冻干研磨后用胃蛋白酶消化、中和后于37℃成胶；以猪脱细胞尿囊膜基质(UBM)为对照。通过H&E及DAPI染色、DNA定量验证脱细胞效果；流变学测定凝胶点及储能模量(G′)；免疫组化检测胶原I/IV、纤连蛋白、层粘连蛋白及GAGs留存；质谱蛋白质组学分析ECM组分；胶原酶消化结合尺寸排阻色谱分离基质结合囊泡(MBVs)，纳米颗粒追踪分析(NTA)、免疫斑点检测外泌体标志物(CD63/CD81/CD9)、单粒子拉曼光谱及与主成分分析(PCA)与HEK-293F细胞来源外泌体比较。人NSC(CTX0E03-DP)与硬脑膜ECM水凝胶混合后经26G针头注射评估存活率(Live/Dead染色)；原代人星形胶质细胞低氧培养加可溶性ECM检测活性氧(ROS, DCFDA法)；人真皮成纤维细胞沉积细胞来源基质(CDM)后经Transwell加ECM水凝胶及/或TGF-β1，用ImageJ插件量化纤维直径、孔隙率及取向。体内采用雄性C57BL/6小鼠控制性皮质撞击(CCI) TBI模型，伤后7天分别给予：(1)假手术(sham)；(2)TBI对照；(3)TBI+硬脑膜ECM水凝胶(7 mg/mL, 2 μL)；(4)TBI+NSC悬液(5×10⁴cells/μL, 2 μL)；(5)TBI+硬脑膜ECM水凝胶(7 mg/mL)复合NSC(5×10⁴cells/μL, 2 μL)，经颅骨钻孔处注射至损伤灶下方-1.5 mm。伤前及伤后3、6、14、21、28天进行加速旋转棒(Rotarod)运动功能测试；伤后7、14、28天灌注取脑，石蜡切片行IBA1(小胶质细胞/巨噬细胞)及GFAP(星形胶质细胞)免疫组化染色并定量。

Generation and Characterization of ECM Dural Hydrogel（硬脑膜ECM水凝胶的制备与表征）

脱细胞后残留DNA<15 ng/mg（低于50 ng/mg标准），H&E与DAPI证实无细胞核；流变学显示37℃数分钟内成胶，储能模量(G′)随ECM浓度(5–8 mg/mL)由231 Pa线性增至716 Pa，7 mg/mL时约600 Pa接近哺乳动物皮质组织刚度；免疫组化显示脱细胞后胶原I、胶原IV、纤连蛋白、层粘连蛋白及GAGs大部分保留，层粘连蛋白和胶原IV信号略有降低。结论：猪硬脑膜可有效脱细胞并形成力学可调、组分保留的温敏原位成胶水凝胶。

In Vitro Performance（体外性能）

NSC载入水凝胶后经26G针头或移液器注射存活率均>90%；低氧条件下星形胶质细胞ROS显著升高，加硬脑膜ECM可溶性提取物可使ROS降至常氧基线水平（UBM对照无此效果）；TGF-β1诱导人真皮成纤维细胞沉积致密、高取向胶原基质，共培养硬脑膜ECM水凝胶可维持网状无规取向基质、抑制纤维化纤维排列。结论：硬脑膜ECM水凝胶对NSC具良好生物相容性，可在体外减轻星形胶质细胞氧化应激并抑制TGF-β1驱动的纤维化基质重塑。

Proteomic Analysis（蛋白质组学分析）

鉴定到559种蛋白质，其中253种具细胞外功能，40种属基质组(matrisome)，包括胶原(检出13种多肽涵盖9个独特类型，VI和XII型略高)、纤连蛋白、光蛋白聚糖(lumican)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)、原纤调蛋白(fibrillin)、核心蛋白聚糖(decorin)等；GO富集显示ECM组织、细胞黏附、对外来刺激应答（含11种热休克蛋白HSPs）等条目显著富集。结论：硬脑膜ECM具复杂的促再生蛋白组成，富含ECM结构与调控分子。

Isolation and Characterization of Matrix-Bound Vesicles（基质结合囊泡(MBVs)的分离与表征）

从硬脑膜ECM消化液中分离到粒径100–200 nm颗粒，表达典型外泌体表面标志物CD63、CD81、CD9；单粒子拉曼光谱示含核酸(DNA/RNA)及脂质特征峰，与HEK-293F外泌体相比脂质和核酸峰更强、苯丙氨酸峰较弱，胶原相关峰明显；PCA显示两类囊泡生化组成显著不同。结论：硬脑膜ECM含基质结合囊泡(MBVs)，其组成区别于传统细胞来源外泌体，具独特脂质–核酸富集特征。

TBI Mouse Model（TBI小鼠模型）

Rotarod测试显示各治疗组较TBI对照组运动功能显著改善：单纯硬脑膜ECM水凝胶组伤后3、7、14天潜伏期延长(P<0.05)；单纯NSC组7、14、21、28天均显著改善(P<0.001~0.0001)，28天均值达假手术组水平；NSC+硬脑膜ECM联合组7天及28天显著优于TBI对照(P<0.05~0.01)。组织学：TBI对照组伤周GFAP⁺星形胶质细胞面积及IBA1⁺小胶质细胞活化显著增加；NSC单独治疗显著降低GFAP及IBA1阳性面积至接近假手术水平；含硬脑膜ECM的治疗组（单独或联合）对IBA1⁺小胶质细胞活化有明显抑制作用但对GFAP⁺星形胶质细胞反应影响较小。结论：硬脑膜ECM水凝胶、NSC及二者联合均可促进TBI后运动功能恢复；硬脑膜ECM主要抑制小胶质细胞/巨噬细胞活化，NSC同时抑制星形胶质细胞反应性胶质增生和小胶质细胞活化，二者未表现出明显的叠加效应。

讨论与结论

研究人员讨论指出，硬脑膜ECM经脱细胞后DNA残留达标、主要ECM蛋白与GAGs保留，7 mg/mL时刚度匹配脑皮质且37℃成胶时间适合颅内注射，NSC经针载后存活率高。体外该水凝胶减轻低氧星形胶质细胞氧化应激并抑制TGF-β1诱导的成纤维细胞纤维化基质排列，符合抗继发性损伤潜力。蛋白质组揭示丰富ECM结构与调控分子（含HSPs、富亮氨酸小蛋白聚糖），MBVs被鉴定为不同于细胞来源外泌体的脂质膜囊泡且保留核酸 cargo，可能参与ECM支架的治疗效应。在小鼠CCI模型中硬脑膜ECM水凝胶单独早期改善运动功能并抑制小胶质细胞活化，NSC单独后期改善运动功能并抑制星形胶质细胞与小胶质细胞活化，联合治疗未呈现明显叠加效益，未来需优化ECM浓度、体积、注射时机与部位。转化需关注组分–疗效关联解析、批次间差异质控及灭菌与长期体内降解安全性。

研究结论翻译：本研究开发了一种猪硬脑膜来源的脱细胞细胞外基质(ECM)水凝胶，并对其组成、力学性能、体外细胞作用及作为神经干细胞(NSC)递送载体治疗小鼠创伤性脑损伤(TBI)的潜力进行了表征。ECM生物材料及NSC单独或联用均产生有益治疗效果，细胞–材料联合体系尚需进一步优化，但硬脑膜ECM水凝胶本身作为一种新型促再生生物材料，在神经系统再生医学中具有研究价值。