选择性5-HT1A受体激动剂NLX-112上调胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）并在帕金森病小鼠模型中对抗MPTP诱导的黑质纹状体变性具有神经保护作用

《ACS Chemical Neuroscience》：NLX-112, a Selective 5-HT1A Receptor Agonist, Upregulates GDNF and is Neuroprotective Against MPTP-Induced Nigrostriatal Degeneration in a Mouse Model of Parkinson’s Disease

　　

NLX-112是一种强效且选择性的5-HT_1A受体激动剂，已成功完成针对帕金森病（Parkinson’s disease, PD）患者左旋多巴（L-DOPA）诱导的运动障碍的2A期临床试验。本研究在PD的1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine, MPTP）小鼠模型中，研究了NLX-112的神经保护活性。四组雄性小鼠分别接受为期15天的皮下注射：生理盐水（1 mL/kg/天）、MPTP（21.4 mg/kg/天，注射5天，前后各加5天生理盐水）、NLX-112（1 mg/kg/天，15天）或MPTP+NLX-112联合处理。停止处理两周后，在旷场实验中，单独接受NLX-112或NLX-112/MPTP联合处理的小鼠表现出运动活动增加和焦虑样行为减少（通过趋触性减少40%进行评估），这与5-HT_1A受体激活的持续效应一致。MPTP处理导致黑质致密部（substantia nigra compacta, SNc）中多巴胺能（即酪氨酸羟化酶免疫反应性，tyrosine hydroxylase immunoreactive, TH-ir）神经元减少40%，纹状体中神经末梢减少55%。NLX-112处理完全阻止了TH-ir神经元的损失，并将MPTP诱导的多巴胺神经末梢损失减少至30%。MPTP还显著增加了黑质中胶质纤维酸性蛋白免疫反应性（glial fibrillary acidic protein immunoreactive, GFAP-ir）星形胶质细胞和小胶质细胞离子钙接头蛋白-1免疫反应性（ionized calcium-binding adapter molecule 1 immunoreactive, Iba1-ir）小胶质细胞的水平，并增加了SNc和纹状体中GFAP-ir星形胶质细胞内胶质细胞源性神经营养因子（glial-derived neurotrophic factor, GDNF）的共表达。NLX-112显著逆转了MPTP诱导的SNc小胶质细胞过度活化，并上调了纹状体和SNc中GFAP/GDNF的共定位。总之，本研究通过阻止小胶质细胞增生、上调GDNF并促进持续的运动前驱活性，证明了NLX-112在PD小鼠模型中具有强大的神经保护作用。

**论文解读：选择性5-HT_1A受体激动剂NLX-112在帕金森病MPTP模型中的神经保护机制与效应**

**研究背景与意义**

帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是一种进行性神经退行性疾病，其病理标志是中脑黑质（substantia nigra, SN）多巴胺能神经元的丧失，导致运动功能障碍。目前尚无获批疗法能够阻止或逆转这一神经元退变过程，因此，寻找能够保护多巴胺能神经元的药物是核心研究重点。胶质细胞源性神经营养因子（glial-derived neurotrophic factor, GDNF）是支持多巴胺能神经元存活、生长和分化的关键神经营养因子，但将其外源性递送至人脑特定区域面临巨大挑战，临床疗效不一。5-羟色胺1A（5-HT_1A）受体是神经保护的一个潜在靶点，因其可调节神经元兴奋性、突触活动和神经胶质细胞反应。NLX-112（又名befiradolor或F13640）是一种首创的、高选择性、强效的5-HT_1A受体偏向性激动剂，已显示出对抗左旋多巴诱导的运动障碍的疗效。本研究旨在探究NLX-112是否能在MPTP诱导的PD小鼠模型中，通过激活5-HT_1A受体依赖的信号通路，提供针对多巴胺能神经变性的保护作用，其研究成果发表于《ACS Chemical Neuroscience》。

**关键技术方法概述**

本研究采用MPTP诱导的C57Bl/6J雄性小鼠PD模型。将48只小鼠随机分为四组：生理盐水对照组、MPTP损伤组、NLX-112单独处理组以及MPTP+NLX-112联合处理组。MPTP采用递增式亚慢性给药方案（皮下注射，连续5天）以降低心血管副作用。NLX-112（1 mg/kg/天）或对照溶剂通过腹腔注射给药，持续15天。在停药14天后进行行为学评估，主要采用旷场实验（open-field test, OFT）视频追踪系统（Noldus Ethovision XT）分析运动活动和焦虑样行为（以趋触性为指标）。随后处死小鼠，取脑组织进行免疫组织化学分析。关键检测指标包括：使用酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）免疫染色定量黑质致密部（SNc）多巴胺能神经元数量和纹状体神经末梢密度；使用离子钙接头蛋白-1（Iba1）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光分别标记小胶质细胞和星形胶质细胞，评估神经炎症反应；同时检测GDNF与GFAP在SNc和纹状体中的共定位情况，以探究星形胶质细胞源性GDNF的上调。细胞计数采用立体学方法，数据统计分析使用混合模型方差分析（ANOVA）及事后检验。

**研究结果分析**

**1. 旷场实验中的行为表现**
停药14天后，与生理盐水对照组相比，接受MPTP+NLX-112联合处理的小鼠在旷场中的总运动距离增加了一倍以上。同时，该组小鼠的停止/启动频率、平均速度、在场地中心的加速频率、进入中心区域的次数以及在中心区域的运动时间均显著增加。这些行为改善表明NLX-112处理增强了运动探索活动，并减少了MPTP可能引起的焦虑样行为（表现为趋触性降低）。单独使用NLX-112也在未损伤动物中增加了运动距离和停止/启动频率。

**2. 黑质多巴胺能神经元及纹状体投射纤维的TH免疫反应性**
MPTP处理导致SNc尾部TH免疫反应性（TH-ir）多巴胺能神经元数量减少约40%，纹状体TH-ir神经纤维密度损失约55%。NLX-112处理完全逆转了MPTP诱导的SNc TH-ir神经元损失。在纹状体，NLX-112将MPTP引起的TH-ir纤维密度损失从55%减弱至30%，表明其对多巴胺能神经末梢具有部分保护作用。单独使用NLX-112对TH-ir细胞数量或纤维密度无影响。

**3. 反应性小胶质细胞增生及Iba1与TH共定位**
免疫组化分析显示，MPTP处理导致SNc中Iba1-ir小胶质细胞数量显著增加，其形态从纤维状转变为更致密且偶尔呈阿米巴样，表明小胶质细胞被激活。这些激活的小胶质细胞在TH-ir神经元缺失的区域更为密集。NLX-112处理完全逆转了MPTP诱导的Iba1-ir细胞数量的急剧增加，并使细胞形态恢复为更接近纤维状。纹状体中仅观察到极少量的Iba1-ir细胞。

**4. 反应性星形胶质细胞增生及GDNF-GFAP共定位**
在SNc，生理盐水、NLX-112单独或MPTP处理组中，GFAP-ir纤维状星形胶质细胞数量均适中。MPTP并未增加这些细胞的数量，但使其形态呈现“激活”状态，形成明显的纤维状终足。与GDNF的双重标记显示，在MPTP损伤且接受NLX-112处理的小鼠中，GDNF免疫反应性与GFAP-ir的共定位显著增加，且具有明显的星形胶质细胞形态。在纹状体，生理盐水或NLX-112处理的正常小鼠中GFAP-ir星形胶质细胞很少。MPTP处理显著增加了GFAP-ir纤维状星形胶质细胞的数量。然而，在MPTP+NLX-112组中，GFAP-ir细胞数量显著减少。同时，MPTP处理后GDNF-ir细胞数量大幅增加，且在MPTP+NLX-112组中进一步增加。纹状体中GFAP-GDNF共定位在MPTP后增加了110%，在NLX-112+MPTP组中更是增加了333%。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，本研究揭示了NLX-112通过一种非多巴胺能机制发挥神经保护作用，该机制涉及胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）。与以往旨在外源性递送GDNF的干预措施不同，NLX-112通过激活5-HT_1A受体上调内源性GDNF的表达，这可能提供了一种更符合生理、效应更持久的神经保护策略。星形胶质细胞是内源性GDNF的关键来源，本研究表明NLX-112刺激了GFAP阳性星形胶质细胞中GDNF的表达，提示其神经保护效应主要由星形胶质细胞介导。值得注意的是，NLX-112仅在MPTP诱导的神经损伤背景下上调GDNF，表明其GDNF诱导作用具有环境依赖性，需要星形胶质细胞被神经毒性或炎症信号“启动”。机制上，研究人员推测NLX-112通过激活星形胶质细胞上的5-HT_1A受体，诱导GDNF分泌；GDNF随后与多巴胺能神经元上的RET受体结合，从而恢复线粒体功能、增强ATP产生、减轻氧化应激并抑制凋亡通路。此外，NLX-112还能减少小胶质细胞增生和神经炎症，为神经元存活提供支持性微环境。行为学的改善很可能源于皮质和纹状体5-HT_1A受体的选择性激活，这些区域对运动控制和情绪调节至关重要。

研究也指出了若干局限性：仅使用了雄性小鼠；仅通过TH-ir评估多巴胺能通路损伤，TH表达下调可能与神经元真实损失混淆；可增加其他运动功能测试（如平衡木、转棒）和其他PD模型（如α-突触核蛋白模型）的验证；未进行GDNF的定量测量（如ELISA或Western blot）及使用GDNF阻断策略的直接机制验证；对线粒体功能和凋亡通路的下游分析超出当前工作范围；黑质区域星形胶质细胞激活的定量评估存在技术限制。

**结论**部分翻译如下：本研究证明，NLX-112在PD的MPTP小鼠模型中表现出强大的神经保护特性。其保护作用通过减弱星形胶质细胞和小胶质细胞的激活、上调内源性GDNF以及保护黑质纹状体多巴胺能神经元而介导。这些细胞效应转化为持续的运动前驱和抗焦虑样行为益处，表明选择性5-HT_1A受体激动剂可能代表了一种用于PD神经保护和疾病修饰的新型且有前景的治疗策略。