利用超高效液相色谱-串联质谱多反应监测技术定量分析大麦叶感染禾谷双极菌后的应激与抗性相关代谢物

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Quantification of Stress- and Resistance-Related Metabolites in Barley Leaves (Hordeum vulgare L.) Infected with Bipolaris sorokiniana via UHPLC-MS/MSMRM

　　

本研究通过超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）技术，调查了禾谷双极菌（Bipolaris sorokiniana）感染在多重亲本巢式关联作图（NAM）群体HEB-25的定量抗性及感病大麦品系叶片中诱导产生的33种应激或抗性相关代谢物的定量变化。研究人员分析了29个感染与非感染大麦基因型在接种后四个不同时间点的情况。该方法实现了对大麦碱（hordatines）、酚酰胺（phenolamides）、羟基肉桂酸（hydroxycinnamic acids）、黄酮葡萄糖苷（flavone glucosides）、羟腈葡萄糖苷（hydroxynitrile glucosides）、脱辅基类胡萝卜素（apocarotenoids）以及吲哚衍生物（indole derivatives）的定量分析。在感染禾谷双硫菌的叶片中，酚酰胺水平相较于未感染植株有所升高。代谢物水平与感染严重程度之间的相关性分析表明，抗性更强的大麦品系含有更高含量的大麦碱及其葡萄糖苷。这些结果有助于理解大麦对真菌病原体的代谢防御机制，并为未来育种计划中抗性标记的开发提供了潜在依据。

### 论文解读：大麦抗禾谷双极菌感染的代谢组学定量研究

#### 一、 研究背景与意义
大麦（Hordeum vulgare L.）是全球第四大谷类作物，其生产主要面临多种生物胁迫，其中由禾谷双极菌（Bipolaris sorokiniana）引起的斑点病是常见且危害严重的真菌病害，可导致25-45%的产量损失。在气候变化导致温度升高的背景下，真菌感染加剧，病原体分布范围向北扩展。为应对这一挑战，并减少对化肥和合成杀菌剂的依赖，培育具有增强抗病性且富含天然防御分子的作物品种至关重要。

植物在应对环境胁迫时，会积累与防御相关的特殊代谢物（生物活性天然产物）。这些代谢物具有多种功能，如作为信号分子、抗氧化剂、化感物质及直接的抗真菌剂。在大麦中，大麦特异性的大麦碱因其抗真菌潜力而闻名。此外，大麦碱的生物合成前体（如对香豆酰胍丁胺）以及其他代谢物如羟腈葡萄糖苷、黄酮葡萄糖苷和吲哚衍生物，也被证明在应对非生物和生物胁迫中发挥作用。然而，这些代谢物在感染过程中的定量动态变化及其与宿主定量抗性之间的具体关系尚不明确。

因此，本研究旨在开发一种高灵敏度的定量分析方法，以测定大麦叶片中与生物胁迫相关的关键代谢物含量，并将其与来自多重亲本巢式关联作图（NAM）群体HEB-25的不同感病性大麦基因型的定量抗性进行关联分析。该研究发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》，对于解析大麦-病原体互作的代谢基础、发掘抗性分子标记以及指导抗病育种具有重要意义。

#### 二、 主要技术方法
为达成研究目标，研究人员开发并验证了一种基于超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）的多反应监测（MRM）定量方法。研究选用了来自HEB-25 NAM群体的29个具有不同抗性水平的大麦基因型作为植物材料。通过喷雾接种禾谷双极菌孢子悬浮液进行感染，并设立喷施蒸馏水的对照组。在接种后第7、10、14和17天，对叶片斑点病症状进行表型评分（病害等级），并采集叶片样本用于代谢物分析。样本经冷冻、称重后，使用含有陶瓷珠的研磨管进行机械匀浆，并加入包含8种内标（IS）的混合物以校正提取和离子化过程中的损失与基质效应。代谢物的分离在C18色谱柱上进行，采用梯度洗脱，质谱检测在正负离子切换的电喷雾电离（ESI）模式下进行。该方法对33种目标代谢物进行了全面的方法学验证，包括线性、准确度、精密度、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。数据分析与可视化借助MetaboAnalyst软件完成，部分标准品浓度通过定量¹H核磁共振（q¹H NMR）光谱法确证。

#### 三、 研究结果
**（一）大麦叶片中应激与抗性相关代谢物的定量**
研究人员成功建立并验证了可同时定量分析33种结构多样性代谢物的UHPLC-MS/MS MRM方法。该方法灵敏度高，所有分析物的回收率在80-131%之间，LOD和LOQ范围分别为0.001–0.366 μmol/L和0.004–1.186 μmol/L。

对大麦叶片代谢物的定量分析发现：
1. **主要代谢物**：黄酮葡萄糖苷皂草苷（saponarin, **16**）是叶片中含量最高的代谢物，范围为0.055–4.46 μmol/g鲜重。
2. **大麦碱及其糖苷**：大麦碱苷元（**1–3**）的含量（最高达2.72 μmol/g鲜重）高于其葡萄糖苷形式（**4–6**, 最高0.085 μmol/g鲜重）。在所检测的叶片中，顺式异构体含量高于反式异构体，其中大麦碱B（hordatine B, **2**）占比最大。
3. **酚酰胺**：类似于大麦碱，所分析的酚酰胺（**7–14**）中顺式异构体含量也更高。大麦碱A和B（**1–2**）的生物合成前体对香豆酰胍丁胺（p-CA, **7**）、阿魏酰胍丁胺（FerAgm, **8**）和对香豆酰羟基胍丁胺（p-CHA, **10**）占主导地位。这是首个使用真实标准品对大麦叶片中大麦碱（**1–6**）和酚酰胺（**7–14**）进行LC-MS/MS-MRM定量的方法。
4. **其他代谢物**：5-羧基布卢门醇C葡萄糖苷（**31**）和新发现的5-羧基二脱氢布卢门醇C葡萄糖苷（**32**）的平均含量分别为0.012 μmol/g鲜重和0.37 μmol/g鲜重。羟腈葡萄糖苷（**20–24**）的含量与文献报道一致，未感染植株中的水平高于感染叶片。色氨酸（**28**）和色胺（**29**）的浓度范围分别为0.019–1.04 μmol/g鲜重和0.0040–0.94 μmol/g鲜重。在分析的羟基肉桂酸（**25–27**）中，阿魏酸（**26**）占主导地位。

**（二）与抗性相关的标记代谢物**
通过将代谢物水平与禾谷双极菌引起的斑点病症状严重程度（病害等级）进行关联分析，研究人员发现：
1. **与抗性正相关**：在抗性更强的大麦品系中，大麦碱（**1–3**）、大麦碱葡萄糖苷（**4–6**）以及大麦碱生物合成的羟基肉桂酰胺（HCAA）前体（**7–9**）的浓度更高（图3）。斯皮尔曼等级相关分析也显示，大麦碱及其糖苷与病害等级呈负相关，提示它们可能与定量抗性相关。
2. **与感病性正相关**：相比之下，黄酮葡萄糖苷（如皂草苷**16**、schaftoside **18**和isoschaftoside **19**）在所有时间点的含量在更感病的品种中更高。色胺（**29**）含量的增加也与对禾谷双极菌的感病性相关。此外，香豆酰胍丁胺衍生物（**10–11**）和布卢门醇C衍生物（**31–32**）也与感病性呈正相关。
3. **大麦碱的诱导反应**：与先前报道不同，本研究未发现大麦碱（**1–3**）存在明显的病原体诱导上调，且大麦碱B（**2**）在感染后显著下降。这挑战了大麦碱作为大麦病害抗性关键贡献者的普遍观点，暗示其作用可能更为复杂且依赖于具体情境。

**（三）与感染相关的标记代谢物**
尽管基因型对代谢组的影响大于禾谷双极菌接种的影响，但研究人员仍识别出在响应病原体时（所有时间点平均）个体代谢物上/下调的相似模式（图4）。
1. **感染诱导上调**：香豆酰胍丁胺类（**8, 10–11**）和布卢门醇C衍生物（**31–32**）与接种效应呈正相关。
2. **健康植株中富集**：黄酮葡萄糖苷（**16, 18–19**）和大麦碱（**1–3**）主要存在于健康对照植株中。

**（四）感染时间点对代谢物水平的影响**
分析不同采样时间点的数据发现，标记代谢物存在时间依赖性的上/下调（图5）：
1. **色氨酸与色胺**：在最早采样点（接种后7天），健康对照植株中色氨酸（**28**）更丰富。随着病程发展，感染叶片中色氨酸水平上升，而未感染植株中下降。相反，色胺（**29**）浓度在所有时间点的感染植株中均高于对照，但在健康和感染样本中均随时间下降。
2. **脱辅基类胡萝卜素衍生物**：5-羧基布卢门醇C葡萄糖苷（**31**）和蚱蜢酮硫酸酯（grasshopper ketone sulfate, **33**）在前三个时间点（接种后7、10、14天）表现出类似行为，其在健康植株中水平下降，而在感染植株中上升。

#### 四、 讨论与结论
**讨论**：
HEB-25 NAM群体的定量抗性可能部分由所测量的标记代谢物解释。然而，生物重复间的波动表明，观察到的禾谷双极菌感染症状除了代谢物浓度外，还受到多种因素的影响。需要指出的是，代谢物浓度与感病或抗性程度之间的正相关不能轻易解释为因果关系。在感病基因型中发展的坏死症状可能与引发次级代谢物积累的组织损伤有关，这甚至可能限制了更极端的病原体扩散。例如，schaftoside（**18**）和色胺（**29**）均与病害感病性相关，但体外实验表明，前者支持而后者抑制禾谷双极菌的生长。尽管如此，了解植物响应生物和非生物胁迫的代谢改变，有助于未来育种计划中疾病的针对性防控。本研究所鉴定的生物标记分子可用于育种材料的筛选，以在真菌感染的早期、症状前阶段检测疾病或抗性。未来的研究需要结合功能实验（如外源施用纯化代谢物、靶向修饰生物合成基因的反向遗传学、或使用具有不同代谢物积累的近等基因系）来验证这些关联的因果关系。整合代谢组学与转录组学或QTL定位的多组学方法，对于全面阐明动态的宿主 - 病原体互作机制至关重要。

**结论**：
本研究成功开发并验证了一种新的LC-MS/MS MRM方法，用于定量分析大麦叶片中的33种代谢物，实现了对广泛结构多样性物质的高灵敏度同步测量。首次测定了大麦叶片中大麦碱A、B、C（**1–3**）、大麦碱糖苷（**4–6**）、黄酮糖苷（**15–19**）、氧化型谷胱甘肽（oxyglutathione, **30**）、酚酰胺（**7–14**）以及新鉴定的5-羧基布卢门醇-C-9-O-?-d-葡萄糖苷（**31**）和5-羧基二脱氢布卢门醇-C-9-O-?-d-葡萄糖苷（**32**）的定量值。所开发的方法能够将标记代谢物的定量测量与所选HEB-25基因型的定量抗性相关联，并能定量测定感染诱导的次级代谢物上调。该方法未来可应用于研究不同大麦品系对生物胁迫的抗性、其他环境与胁迫因素或处理效应。进一步利用大麦突变体（其中形成已鉴定抗性相关代谢物的个体生物合成通路被沉默或过表达）进行实验，可以确认本研究中与抗性相关的代谢物是否对其抗性负责。