以100赫兹频率对光刺激神经活动进行双光子三维成像

《Light-Science & Applications》：Two-photon 3D imaging of optically stimulated neural activity at 100?Hz

　　

摘要：
理解神经元如何整合突触输入，需要能够捕捉快速、三维树突事件的成像技术。这些过程发生在毫秒时间尺度和亚微米空间尺度上，超出了传统双光子显微镜（2PM）的速度。研究人员开发了双视图贝塞尔双光子投影显微镜（dv-B2PM），这是一种高速容积成像方法，能够以突触水平的分辨率实现100赫兹的全容积采集。dv-B2PM同时记录同一三维容积的两个正交投影，在保留空间信息的同时，最大限度地减少了结构重叠带来的模糊性。结合dv-B2PM与双光子谷氨酸解笼锁技术，研究人员在局部刺激后可视化了神经元中的三维钙离子（Ca²⁺）动态。多时间尺度分析揭示了从树突到胞体的Ca²⁺信号传播、从胞体反向传播的Ca²⁺信号，以及沿顶端树突激活的、速度从每秒数十微米到每秒数毫米的多频率（5–40赫兹）Ca²⁺瞬变。这些发现表明，dv-B2PM是一种强大的工具，可直接可视化与扩展神经元结构中树突整合相关的三维钙离子动力学，从而弥合光学成像与神经元整合的动态生物物理学之间的鸿沟。

论文解读：

**研究背景与存在问题**
理解神经元如何进行计算，需要观察它们在空间和时间上是如何整合突触输入的。现代神经成像技术对此至关重要，它使研究人员能够可视化活体神经回路中的电信号和生化信号。其中，树突整合起着核心作用：兴奋性和抑制性突触输入通过复杂的非线性机制在树突分支上整合，决定了神经元如何编码和传输信息。这些计算涉及复杂的钙离子（Ca²⁺）工具包，产生丰富的时空活动，从快速的局部突触Ca²⁺瞬变到反向传播的动作电位（bAPs）以及沿延伸树突分支传播的钙波。捕捉此类事件需要一个能够在大体积三维神经元结构内解析亚微米空间特征和毫秒级时间动态的成像系统。

双光子显微镜（2PM）因其深组织穿透性、光学限制激发、低背景和最小光损伤，长期以来一直是神经成像的基石。然而，传统的2PM技术依赖于点扫描，这本质上限制了其成像速度。与单光子显微镜或膜片钳记录等电生理技术相比，2PM在深部组织中提供了优越的空间分辨率和低背景成像，但其较慢的采集速度仍然是研究神经元内发生的快速三维计算的关键瓶颈。虽然可以通过定制扫描速度倍增器将2PM成像速度提高到千赫兹帧率范围，但由于积分时间大大缩短，信噪比会下降。并行激发也可以同时采集多个帧，但倍增因子受到活体生物样本中激光功率安全限制的限制。此外，即使千赫兹帧率，由于大多数三维组织需要接近数十层的三维扫描，也只能转化为每秒几十个体积。

活体神经活动对高速成像提出了额外的挑战。此类应用中的微弱信号通常迫使成像仪器以较低速度运行以提高信噪比。例如，高速单光子激发光片仪器在结构成像中实现了每秒300个体积，但在成像胞体活动时降至每秒6个体积。在精细神经结构（如棘突和树突）的2PM成像中，这一挑战更为严峻，因为这些精细结构的信号，加上2PM较低的激发率，比来自胞体的单光子信号要弱得多。

**研究动机与目标**
为了克服传统成像方法在速度、分辨率和信息完整性方面的限制，研究人员开发了双视图贝塞尔双光子投影显微镜（dv-B2PM），旨在实现高速、高分辨率的三维容积成像，以直接可视化与树突整合相关的快速三维钙离子动力学。这项研究发表在《Light-Science & Applications》期刊上，旨在弥合光学成像速度与神经元整合动态生物物理学之间的差距。

**关键技术方法**
研究人员采用的主要关键技术方法包括：
1. **双视图贝塞尔双光子投影显微镜（dv-B2PM）**：该技术基于双光子贝塞尔光片显微镜进行硬件改进。系统采用两个90度相对配置的物镜，利用贝塞尔光束对成像体积进行光栅扫描，形成一个延伸的薄双光子光片。dv-B2PM的关键创新在于其双视图采集模式：系统在每个高速体积扫描期间，同时从正交角度采集两个同步的投影图像，一个由光电倍增管（PMT）记录，另一个由相机记录，其焦平面动态跟踪贝塞尔光束。这种方法将容积信息压缩到单次曝光中，消除了机械聚焦和相机读出造成的延迟，同时两个正交视图保留了三维空间信息。
2. **双光子谷氨酸解笼锁技术**：将dv-B2PM与双光子谷氨酸解笼锁技术结合，用于对神经元进行局部、受控的突触刺激，以研究刺激后的三维钙离子动态。解笼锁激光通过独立控制的二维激光扫描仪进行横向定位，并通过电调谐透镜（ETL）控制轴向聚焦。
3. **样本队列**：实验使用表达GCaMP8m（一种基因编码的钙离子指示剂）的Thy1-YFP-H转基因小鼠和C57BL/6小鼠的脑切片。通过立体定向注射将病毒（AAV9.CamKII 0.4.Cre.SV40 × CAG-FLEX-GCaMP8m）递送至5-6周龄C57BL/6小鼠的运动皮层（M1），以稀疏标记神经元。从病毒注射四周后的小鼠制备300微米厚的冠状脑切片用于成像。

**研究结果**
**双光子谷氨酸解笼锁靠近单个树突**
结合快速容积dv-B2PM成像和精确的双光子谷氨酸解笼锁，能够在受控刺激下可视化树突Ca²⁺活动。研究人员在GCaMP8m标记的运动皮层（M1）第5/6层脑切片中，选择靠近树突棘的位置进行解笼锁刺激。在重复解笼锁事件期间捕获了Ca²⁺活动。观察到两种不同的时空Ca²⁺活动模式：第一种对应于阈下刺激，产生的Ca²⁺信号局限于解笼锁位点周围的短树突段；第二种反映阈上刺激，导致Ca²⁺活动扩散到胞体和额外的树突分支。通过调整解笼锁激光功率，可以在同一神经元内可靠地诱发阈下和阈上活动模式。

**Ca²⁺信号的长时程时空分析**
dv-B2PM捕获的Ca²⁺信号显示出丰富的空间和时间信息。在空间上，在阈下和阈上刺激下，沿顶端树突出现了一系列具有高平均钙离子水平的“热点”，这些热点间隔约5-15微米，在所有解笼锁功率水平下位置固定。在时间上，Ca²⁺信号显示出叠加了快速波动的慢变峰-衰动态。强解笼锁刺激（80 mW）在胞体和直接与胞体相连的树突段引发了显著的缓慢上升的Ca²⁺激增，表明神经元产生了阈上反应。在解笼锁位点和胞体之间的树突区域，Ca²⁺信号反映了两个成分的混合：一个类似于解笼锁点附近局部树突响应的早期上升峰，以及一个类似于胞体响应的较慢的次级激增。这两种峰类型共存，强烈表明观察到的Ca²⁺信号既来自初始阈上输入信号的树突整合，也来自起源于胞体的反向传播动作电位（bAPs）。长时程动力学峰拟合进一步支持了这一解释。早期峰（或单峰）的传播速度朝向胞体约为24微米/秒，朝向远端约为77微米/秒。相比之下，晚期峰最早出现在胞体，并以约25微米/秒的速度逐渐延迟向解笼锁位点传播。

**Ca²⁺瞬变的短时程时空分析**
为了分离短时程上混杂着随机噪声的Ca²⁺瞬变，研究人员对时空Ca²⁺活动图应用了二维连续小波分析变换。该分析利用小波核在四个时间尺度上定位单个峰-谷波动。生成的小波图揭示了5-40赫兹的Ca²⁺瞬变。最显著的移动瞬变时空轨迹起源于解笼锁时空点，并沿树突双向移动，与初始解笼锁诱发的树突Ca²⁺信号的树突传播一致。其他轨迹的出现和消失取决于解笼锁功率和频率范围。这些Ca²⁺瞬变的运动涵盖了沿树突的快速、慢速、长距离和区域性信号传输。例如，一个5-10赫兹频段的长距离移动Ca²⁺瞬变在刺激后立即以约1.5毫米/秒的速度向胞体传播，表明快速的长距离信号传输。多个5-20赫兹瞬变在刺激位置启动，以每秒数十至数百微米的速度区域性传播，并以热点处持续的高水平瞬变结束，表明Ca²⁺热点是区域性信号传输的终点，并在接收到信号时产生持续的局部Ca²⁺瞬变。

**讨论与结论**
**成像性能**
双视图贝塞尔双光子投影显微镜（dv-B2PM）支持在120 × 80 × 42微米³的视场体积内以每秒100个体积（VPS）的速度成像，光学体素分辨率为0.5 × 0.5 × 0.75微米³，并以0.3 × 0.3 × 0.3微米³的数字体素大小进行奈奎斯特采样。通过三维顺序扫描以相同分辨率成像相同体积将需要14千赫兹的有效帧率，对应于1.7千兆赫兹的像素率。由于双光子激光器的重复频率、与高速图像采集相关的高读出噪声以及来自亚微米结构的微弱信号等关键限制，这样的帧率或像素率尚未应用于三维突触分辨率神经成像。投影成像将三维信息压缩到较慢的二维图像采集中，从而避免了激光重复频率和高速读出噪声的限制，但传统的投影方法会丢失深度信息。立体投影成像被引入以恢复深度信息，但两个立体视图之间的微小角度限制了深度分辨率，无法达到突触水平。dv-B2PM使用双正交视图投影，并在所有维度上保持亚微米分辨率。由于两个视图投影由两个物镜独立检测，系统收集的光子数大约是立体投影检测的两倍，因此能更好地捕捉突触水平的细微活动。作为贝塞尔光束双光子光片成像的升级，dv-B2PM由于贝塞尔光束的自愈特性，在散射组织中保留了高效的双光子激发。dv-B2PM的发射图像在深部组织中确实会经历分辨率下降，但由于抗散射激发和双光子激发的空间限制，其下降速度比单光子光片显微镜慢得多。因此，dv-B2PM在脑组织中保持突触水平分辨率可达120微米深度。dv-B2PM可以被视为具有双光子发射的双角度计算机断层扫描（CT）。通过双正交视图投影，dv-B2PM能够解析垂直于其中一个投影平面的树突结构。然而，作为一个双角度CT类系统，仍存在一些局限性。首先，dv-B2PM需要稀疏的神经元标记（所有神经元成像的常见要求），因为密集结构会降低将信号分配给三维位置的准确性。其次，在信噪比较低且信号在空间上与主要结构断开连接的次要分支树突中，活动追踪的可靠性较低。这些局限性可以通过带有次级结构标记的双通道成像来缓解。

**高时空分辨率成像三维神经元动力学**
神经元信息处理依赖于树突整合、信号向胞体传播以及从胞体返回树突的反向传播动作电位（bAPs）之间的动态相互作用。尽管数十年的电生理学和光学研究已经探索了这些机制，但在三维树突分支内可视化时空信号流仍然是一个重大挑战。神经元信号发生在复杂的形态上，跨越截然不同的时间尺度，其表达强烈依赖于突触激活的位点、时间和强度。因此，捕捉这些动态需要结合毫秒时间精度和亚微米容积分辨率的成像工具——这是现有技术在很大程度上无法实现的组合。传统的光学成像方法通常以牺牲空间覆盖范围为代价来换取速度。选区成像捕获受限区域的活动，遗漏了其他地方的事件。二维投影成像折叠了三维信息，并在树突重叠或垂直于投影平面延伸时引入结构模糊性。千赫兹帧率2PM虽然比标准共振扫描2PM快得多，但需要限制三维扫描的层数以实现快速的容积成像速率。光场成像牺牲空间分辨率以实现单次三维成像能力。这些局限性模糊了树突计算的关键方面，包括平台电位的启动和传播以及Ca²⁺信号在树突分支上的扩散。值得注意的是，作为一种在组织中提高高分辨率三维成像速度的技术，dv-B2PM平台可以与基因编码的电压指示剂结合，以可视化电压动力学，从而直接测量神经计算信号。然而，当前的电压敏感指示剂通常提供比钙离子指示剂低得多的信噪比，特别是在深部脑组织和本研究所需的容积成像速度下。钙成像虽然不是膜电压传播的直接测量，但仍然是研究完整神经组织中树突整合时空后果的最实用和最有价值的方法，特别是在dv-B2PM实现的高分辨率高速成像研究中。

通过将dv-B2PM与双光子谷氨酸解笼锁相结合，研究人员以100赫兹刷新率对三维树突Ca²⁺进行了可视化。这种方法揭示了空间异质性的Ca²⁺瞬变，其标称频率为5至40赫兹，沿连续的树突路径演变，以及以大于毫米/秒速度传播的高频Ca²⁺瞬变。这种覆盖整个神经元的快速局部事件，以前用传统显微镜无法获得，可能构成了塑造神经元计算的树突平台电位生成和信号求和机制的基础。除了其在单细胞生理学中的直接应用外，dv-B2PM为探索回路水平整合提供了一个强大的框架。其双视图设计允许在相互连接的树突域上对突触活动进行容积映射，为研究跨神经元的信号传播、树突集合的可塑性以及神经元微回路的时空协调开辟了新的机会。

总之，这些结果确立了dv-B2PM作为一个先进的纯光学平台，用于剖析神经元整合的原理。通过弥合成像速度与容积分辨率之间的差距，dv-B2PM能够捕捉传统容积成像方法不易获得的快速三维钙离子动力学，为了解树突网络的结构和动态如何产生大脑的计算能力提供了一个新的窗口。