应用CERO 3D生物反应器大规模制备高质量脑类器官(cerebral organoids)的优化方案

《Journal of Neural Transmission》：A refined protocol for the large-scale production of high-quality cerebral organoids

　　

摘要：人多功能干细胞(human pluripotent stem cell, hPSC)诱导的脑类器官(cerebral organoid)是研究早期脑发育及神经发育疾病的重要模型，但现有方法普遍存在类器官大小及细胞组成高度不均一、难以大规模制备，且不同干细胞系神经外胚层(neuroepithelium)形成效率差异大等问题，影响实验重复性与可比性。为此，研究人员开发了基于CERO 3D生物反应器的培养方案，可实现可扩展的类器官生产并改善大小均一性。此外，研究人员对两株不同细胞系来源的单个人脑类器官进行了基于质谱(mass spectrometry, MS)的蛋白质组学分析，初步探讨类器官大小变异性是否与蛋白表达差异相关。结果表明，CERO 3D生物反应器中生成的类器官可重复形成神经外胚层结构并表达关键神经发育标志物。本方案为高效制备脑类器官提供了可行途径，有助于提升神经发育研究中的重现性与高通量应用能力。

论文解读——《Journal of Neural Transmission》发表研究：应用CERO 3D生物反应器大规模制备高质量脑类器官的优化方案及蛋白质组学评估

一、研究背景与立项依据

人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cell, hiPSC)来源的脑类器官(cerebral organoid)是研究人类早期大脑发育及神经发育障碍疾病（如小头畸形、自闭症谱系障碍等）的重要三维(three-dimensional, 3D)体外模型。然而传统基于多孔板或轨道摇床的培养方法存在明显局限：(1)同一hiPSC系甚至同批次培养的类器官在大小、形态及细胞组成上存在显著个体差异(stochastic heterogeneity)；(2)胚状体(embryoid body, EB)向神经外胚层(neuroepithelium)的分化效率在不同hiPSC系间波动较大（通常仅30%–80%），部分细胞系在传统条件下几乎不形成神经芽(neural bud)；(3)常规方法劳动强度大、通量低、难以规模化，大量制备时需消耗巨额培养基并增加污染风险，严重制约下游分子生物学分析（如转录组、蛋白质组）的重现性。针对上述技术瓶颈，研究人员引入近微重力(near-microgravity)交替旋转悬浮培养系统——CERO 3D台式生物反应器(benchtop bioreactor)，旨在建立可规模化、提高大小均一性并促进低效细胞系神经外胚层形成的脑类器官制备新方案，并通过单类器官质谱蛋白质组学(data-independent acquisition, DIA)探索大小异质性与分子表型的关系。

二、主要关键技术方法

研究人员纳入12例不同供体来源hiPSC系（由毛囊角质细胞、外周血单个核细胞PBMC或皮肤成纤维细胞重编程获得并经鉴定），采用AggreWell 800板进行EB形成（接种密度3000 cells/microwell），经STEMdiff? Cerebral Organoid Kit分阶段神经诱导；第8天EB分别转入包被基质胶(Matrigel, MG)的低吸附24孔板轨道摇床培养（传统法）或CERO 3D生物反应器管（含扩张培养基expansion medium, EM + 3% MG，第11天换成熟培养基maturation medium, MM，每3–4天换液）。采用Echo Rebel显微镜采集图像，基于Segment Anything Model的AI辅助图像分割结合人工校验测定类器官投影面积；免疫荧光(immunofluorescence, IF)检测第40天(d40)类器官中PAX6、SOX2（神经祖细胞）、TBR2（中间祖细胞intermediate progenitor cell）、TUJ1/CTIP2/TBR1（分化神经元）表达；单类器官经蛋白聚集捕获(protein aggregation capture, PAC)法制备肽段，nanoLC?MS/MS进行DIA模式检测，Spectronaut软件分析；统计学上计算方差比(variance ratio)、Wilcoxon符号秩检验评估大小变异性，主成分分析(principal component analysis, PCA)及马氏距离(Mahalanobis distance)近似评估蛋白质组差异，基因本体论(Gene Ontology, GO)富集分析区分大小相关与细胞系相关差异蛋白。

三、研究结果

Neuroepithelial development and marker expression in cerebral organoids cultured in the CERO 3D bioreactor（CERO 3D生物反应器中培养的脑类器官神经外胚层发育及标志物表达）

研究人员选取神经外胚层形成能力强（iPSC line 3, MR?013）与弱（iPSC line 10, WLZ368，传统板上几无神经芽）的两株hiPSC进行比较。结果显示，line 3在两系统中均可形成扩张神经外胚层及神经芽；而line 10在传统板上极少形成神经芽，但在CERO 3D生物反应器中可稳定形成明显神经外胚层结构。d40类器官IF染色证实两系来源类器官均表达PAX6、SOX2、TBR2、TUJ1、CTIP2及TBR1，表明CERO 3D系统支持典型皮层区域神经元及祖细胞谱系的发育。

Organoids can be produced efficiently in the CERO 3D bioreactor at scale（CERO 3D生物反应器可高效大规模生产脑类器官）

单根CERO 3D管单次可培养多达约1200个脑类器官（每管30 mL培养基，每周换液两次）；同等数量采用传统6孔板需约10块板（每孔~20个类器官）、每周消耗~360 mL培养基（每孔3 mL × 2次）。证明CERO 3D系统大幅降低人力操作时间与培养基消耗。

Organoid size?associated and line?associated proteomic variability（类器官大小相关及细胞系相关的蛋白质组学变异性）

对CERO 3D培养的同一hiPSC系内不同重量单类器官（line 9 SK55: 36/42/64 μg；line 10 WLZ368: 40/52/140 μg）进行DIA蛋白质组学（n=3/系，最终6736个共有蛋白）。结果发现：同一系内，类器官重量差越大，全局蛋白质表达谱差异（PCA空间欧氏距离近似的马氏距离）也越大，说明大小异质性伴随分子水平差异；GO分析显示大小相关差异蛋白富集于发育及信号转导过程（developmental and signal?transduction?related processes），提示不同大小类器官可能处于略有不同的神经发育阶段。两系间即便重量相近仍存在蛋白质组差异，系间差异贡献蛋白富集于RNA代谢、核糖体发生(ribosome biogenesis)及基因表达等核心细胞过程，属细胞系遗传背景相关变异。表明控制类器官大小对下游分子比对至关重要。

Organoids produced in CERO 3D are more homogeneous than organoids grown on plates（CERO 3D培养的类器官比平板培养类器官更均一）

分析8个hiPSC系来源共1340个类器官（板培养991个观测值，CERO 3D管349个观测值，d0–d71共19个测量日）的大小（面积）变异性。17/19个测量日中板培养原始方差大于管培养，管/板方差比中位数为0.289（即板培养大小变异性约为管的3.5倍）；Wilcoxon符号秩检验V=25, p=0.003，证实CERO 3D管培养显著降低类器官大小离散度，至d100仍保持更均一外观。残留不均一性主要源于AggreWell微孔中EB部分融合及生物反应器管内早期偶尔粘连。

四、讨论与结论总结

讨论指出，尽管CERO 3D系统仍有少量残余大小异质性（源自EB融合与偶尔类器官合并），但其可通过大规模产出后挑选大小匹配(size?matched)类器官进一步降低分析噪音。CERO 3D生物反应器的近微重力连续悬浮改善了营养与气体扩散、减少机械应力，故不仅提升类器官大小均一性，还挽救了传统条件下神经外胚层诱导低效hiPSC系的神经分化能力，突破了细胞系依赖性限制。探索性蛋白质组学提示类器官大小差异关联发育/信号通路蛋白表达变化，强调在分子水平比对研究中需控制大小变量。与传统法相比，该系统减少手动操作、降低耗材与污染风险，适合药物筛选、毒理及患者来源类器官比较研究。

结论翻译：

本研究提出了一种利用CERO 3D台式生物反应器制备脑类器官的优化且可规模化方案。该方案能大规模产生具改善的大小均一性及跨hiPSC系稳健神经外胚层形成的脑类器官，解决了传统平板法关键技术局限。探索性蛋白质组学分析进一步揭示类器官大小为分子变异性的贡献因素，强调了尺寸控制在下游应用中的重要性。综上，CERO 3D生物反应器可作为神经发育研究中可重现、高通量脑类器官培养的实用平台。