《Plant Biotechnology Journal》：Development of In Vitro and In Planta Strategies for Efficient Production of High-Value Steviol Glycosides
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甜菊醇糖苷是一类存在于甜叶菊（Stevia rebaudiana）中的具有甜味的二萜糖苷。高价值甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D（Reb D）和莱鲍迪苷M（Reb M）的生产受限于莱鲍迪苷A（Reb A）向莱鲍迪苷D（Reb D）以及甜菊苷（stevioside）向莱鲍迪
甜菊醇糖苷是一类存在于甜叶菊（Stevia rebaudiana）中的具有甜味的二萜糖苷。高价值甜菊醇糖苷莱鲍迪苷D（Reb D）和莱鲍迪苷M（Reb M）的生产受限于莱鲍迪苷A（Reb A）向莱鲍迪苷D（Reb D）以及甜菊苷（stevioside）向莱鲍迪苷E（Reb E）转化效率低下。为解决这一问题，研究人员考察了联合使用甜叶菊UDP-糖基转移酶SrUGT76G1与来源于谷子（Setaria italica）的一种UDP-糖基转移酶SiUGT，以增强甜菊醇糖苷生物合成。既往研究已表明，SiUGT可在酵母中高效催化Reb A和甜菊苷分别转化为Reb D和Reb E。通过体外酶促测定，研究表明，将SrUGT76G1与SiUGT联合使用可显著提高转化效率，并鉴定出甜菊苷是更有利的起始底物，因为其可减少不期望副产物的形成。随后，研究人员通过瞬时转化和稳定转化，在异源宿主本氏烟（Nicotiana benthamiana）中分别表达SrUGT76G1、SiUGT及二者的融合蛋白。尽管在N. benthamiana中瞬时表达SrUGT76G1或SiUGT时主要产生中间型甜菊醇糖苷，但在补加底物后，瞬时表达SrUGT76G1-SiUGT融合蛋白可生成Reb D和Reb M。同样，稳定转基因N. benthamiana品系在表达融合构建体SrUGT76G1-SiUGT后能够积累Reb D和Reb M，且其产量与转基因表达量呈正相关。总体而言，本研究建立了一个经优化的体外酶促系统，用于高效生产Reb M，并证明了N. benthamiana作为植物体内（in planta）异源甜菊醇糖苷生物合成平台的可行性，从而提供了具有潜在工业应用价值的高价值甜菊醇糖苷生产新策略。
该论文发表于《Plant Biotechnology Journal》，围绕高价值甜菊醇糖苷的生物制造展开，重点解决莱鲍迪苷D（Reb D）与莱鲍迪苷M（Reb M）天然含量低、转化路径受限和生产效率不足的问题。甜菊醇糖苷（steviol glycosides，SGs）作为零热量天然甜味剂，因不在上消化道被消化吸收、具有良好的代谢安全性而在食品工业中受到高度关注。现有甜叶菊（Stevia rebaudiana）提取物中，甜菊苷（stevioside）和莱鲍迪苷A（Reb A）是主要成分，但二者口感仍存在一定苦后味；相比之下，Reb D和Reb M甜度更高、苦后味更轻，因而更具应用价值。然而，这两类高价值SGs在甜叶菊中的天然丰度极低，成为产业化利用的主要瓶颈。尤其是Reb A向Reb D的转化步骤受上游UDP-糖基转移酶（UGT）活性限制，导致后续Reb M合成亦受牵制，因此有必要建立更高效的体外与植物体内生产体系。
研究人员围绕甜叶菊来源SrUGT76G1和谷子来源SiUGT的协同作用展开研究。SrUGT76G1可催化甜菊苷生成Reb A，并可进一步催化Reb D生成Reb M；SiUGT则可催化Reb A生成Reb D，并可将甜菊苷转化为Reb E。研究通过体外酶促体系评估两种酶各自及联用时的底物转化效率，并进一步在本氏烟（Nicotiana benthamiana）中通过瞬时表达和稳定遗传转化验证其植物体内（in planta）异源合成能力。结果表明，联用SrUGT76G1与SiUGT可显著提高高价值SGs的合成效率，其中以甜菊苷作为起始底物更有利于Reb M积累，因为其可减少Reb I等副产物的形成。进一步地，SrUGT76G1-SiUGT融合蛋白在本氏烟中可稳定驱动Reb D和Reb M生成，且产量与转基因表达水平相关。研究由此建立了优化的体外酶法生产路线，并证明本氏烟可作为高价值SGs异源生物合成平台，具有重要的方法学与应用价值。
本研究主要采用以下关键技术方法：首先构建并纯化GST标记的重组SrUGT76G1与SiUGT蛋白，开展体外酶促反应，结合超高效液相色谱（UHPLC）检测不同底物和酶量条件下的产物转化谱；其次构建SrUGT76G1、SiUGT及SrUGT76G1-SiUGT融合表达载体，通过农杆菌介导的瞬时转化和稳定转化在本氏烟中表达；再次，对转基因品系进行逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测转基因表达量，并在补加甜菊苷或Reb A底物后，采用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）进行植物样品中SGs定性定量分析。植物材料主要为本氏烟瞬时侵染叶片和独立稳定转基因品系。
2.1 Enzymatic Activity of SrUGT76G1 and SiUGT
研究人员首先在体外系统中解析SrUGT76G1与SiUGT的底物特异性和催化效率。结果显示，SrUGT76G1对甜菊苷向Reb A的转化效率很高，仅用2 μg GST-SrUGT76G1即可几乎完全将0.3 mM甜菊苷转化，其中Reb A相对产率为93.2%，另有6.8%进一步转化为Reb I。相比之下，SrUGT76G1催化Reb D向Reb M转化时效率较低，2 μg酶仅可转化60.4%的Reb D，需要增加至30 μg时才达到86.6%的最大转化率。这表明SrUGT76G1更偏好催化甜菊苷C13位葡萄糖基上的糖基化，而对Reb D进一步形成Reb M所涉及的反应需要更高酶量。
对于SiUGT，研究显示其对Reb A向Reb D的转化呈明显剂量依赖性。低剂量2 μg GST-SiUGT不足以产生显著转化，而当酶量提高至50 μg和200 μg时，转化率分别上升至40.4%和96.8%。这说明SiUGT能够高效完成Reb A向Reb D这一限速步骤，但需要较高酶丰度。另一方面，SiUGT虽也可催化甜菊苷生成Reb E，但效率明显较低，50 μg和200 μg酶量下转化率分别仅为15.5%和54.2%，提示其底物偏好更倾向于Reb A而非甜菊苷。
在联合酶促体系中，研究人员采用200 μg SiUGT配合20–30 μg SrUGT76G1，并分别以Reb A和甜菊苷为底物。结果显示，两种底物条件下均可形成Reb A、Reb I、Reb D和Reb M，且Reb M始终为主要产物，占总检测SGs的63.3%–70.6%。然而，不同底物显著影响副产物谱：当以Reb A为底物时，Reb I占比较高，为20.4%–25.1%；而以甜菊苷为底物时，Reb I比例降至12.6%–16.6%，同时Reb D占比上升。随着SrUGT76G1用量增加，Reb A底物体系中Reb M产率反而下降，而甜菊苷底物体系中Reb M产率则上升至70.6%。这一结果说明，以甜菊苷为起始底物更能引导代谢流避开Reb I形成，从而提高Reb M产出。因此，研究人员据此确定：30 μg SrUGT76G1与200 μg SiUGT、并以甜菊苷为底物，是体外生产Reb M的较优条件。
2.2 Production of SGs by Transient Expression of SrUGT76G1 and SiUGT in N. benthamiana
针对甜叶菊自身转基因繁殖受自交不亲和和低萌发率限制的问题，研究人员转向本氏烟作为异源表达宿主。本氏烟是广泛应用于瞬时表达和代谢工程的模式植物，适合作为植物体内合成平台。研究人员通过农杆菌介导瞬时转化，在本氏烟叶片中分别表达SrUGT76G1、SiUGT及SrUGT76G1-SiUGT融合蛋白，并在2 d后补加甜菊苷底物。结果表明，对照样品中甜菊苷仍为主要成分；表达SrUGT76G1时形成Reb A，表达SiUGT时形成Reb E，而表达融合蛋白时则能够同时检测到Reb A、Reb D和Reb M，说明融合蛋白在植物细胞内具备完整的多步催化能力。研究还检测到甜菊双糖苷（steviolbioside），提示外源补加甜菊苷在本氏烟中存在一定不稳定性并发生部分降解。
当以Reb A作为补加底物时，表达SiUGT的叶片可生成Reb D；而表达SrUGT76G1-SiUGT融合蛋白时，Reb A被进一步消耗并生成Reb D和Reb M。相比单独表达SiUGT的样品，融合蛋白样品中Reb D水平较低而出现Reb M，说明Reb D在融合体系中继续被SrUGT76G1转化为Reb M。这一结果与体外酶促实验高度一致，证明融合蛋白在植物体内同样具有功能连续性。综合瞬时表达结果，研究认为甜菊苷和Reb A都可作为底物驱动Reb M生成，但甜菊苷更稳定、来源更丰富，且在融合表达体系中更适合作为植物体内生产底物。
2.3 Stable Expression of SrUGT76G1 and SiUGT in Transgenic N. benthamiana
为进一步验证本氏烟作为长期生产平台的可行性，研究人员构建了稳定表达SrUGT76G1、SiUGT和SrUGT76G1-SiUGT的转基因本氏烟品系，并筛选高表达独立株系进行底物转化分析。补加甜菊苷后，SrUGT76G1转基因株系产生Reb A，SiUGT株系积累Reb E，而融合基因株系则产生Reb A、Reb D和Reb M，与瞬时表达结果一致。不同株系间的产物差异与转基因表达量密切相关，例如SrUGT76G1_8因表达量最高而可完全将甜菊苷转化为Reb A；SiUGT各株系中Reb E积累量也与SiUGT转录水平一致。融合株系中，SrUGT76G1-SiUGT_2可检测到Reb M，而SrUGT76G1-SiUGT_3则仅检测到Reb D而无Reb M，提示较低的SrUGT76G1表达限制了后续Reb D向Reb M的转化。
补加Reb A后，SiUGT转基因株系能够高效生成Reb D，且效率与SiUGT表达量正相关。单独表达SrUGT76G1的稳定株系未检测到带有额外葡萄糖基的下游SGs，说明在植物体内，SrUGT76G1催化Reb A向Reb I转化极低效。融合株系则可由Reb A同时生成Reb D和Reb M，进一步证明融合构建在稳定遗传背景下仍保持完整活性。此外，当Reb A未被有效转化时，本氏烟中可观察到其降解为甜菊苷和Reb B，说明底物稳定性同样影响植物体内生产效率。整体而言，稳定转基因实验验证了本氏烟能够作为高价值SGs持续生产平台，且Reb M积累依赖足够的融合基因表达水平，特别是前体甜菊苷向Reb A的高效转化。
讨论部分指出，本研究一方面完成了SrUGT76G1与SiUGT体外协同酶促体系的优化，明确甜菊苷是更优起始底物，并获得较高比例的Reb M；另一方面证明了本氏烟可通过瞬时或稳定表达实现高价值SGs的植物体内异源生物合成。研究强调，融合蛋白策略有助于实现两种酶的协同表达和功能耦联，从而提高目标产物生成效率。讨论还指出，未来可考虑采用柔性连接肽构建更便于表达与纯化的融合酶，或通过酶固定化提高体外系统的可重复利用性和工业可持续性。对于植物平台，作者提出可进一步将KAH13、UGT85C2、UGT91D2和UGT74G1等上游基因共同导入本氏烟，以期直接在植株内合成甜菊苷前体并进一步生成高价值SGs，从而减少外源底物补加需求。作者同时提及，甜叶菊细胞悬浮培养也是潜在的体内生产体系，可绕开整株甜叶菊繁殖困难的问题。
研究结论部分可概括为：本研究建立了一个优化的体外酶促系统，可高效生产Reb M，并证明本氏烟可作为植物体内异源甜菊醇糖苷生物合成平台。通过联合使用SrUGT76G1与SiUGT，尤其采用SrUGT76G1-SiUGT融合构建，能够从甜菊苷或Reb A出发生成Reb D和Reb M，其中甜菊苷是更有利的起始底物。稳定转基因本氏烟中Reb D和Reb M的积累与转基因表达水平呈正相关。该研究为高价值甜菊醇糖苷的工业化生产提供了新的体外酶法和植物体内合成策略。
