《Small》：3D-Printed Milli-Fluidic Mixing-Extrusion Platform for Continuous, High-Throughput LNP Production
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脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）已成为信使核糖核酸（mRNA）疫苗和基因药物等治疗剂的重要递送载体。然而，当前制造技术在精准性、可扩展性和成本效益之间难以取得平衡。尽管微流控混合可实现优异的颗粒控制，但其面临通道污染和对昂贵的
脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）已成为信使核糖核酸（mRNA）疫苗和基因药物等治疗剂的重要递送载体。然而，当前制造技术在精准性、可扩展性和成本效益之间难以取得平衡。尽管微流控混合可实现优异的颗粒控制，但其面临通道污染和对昂贵的单次使用芯片的依赖等操作挑战，这些瓶颈制约了LNPs的可重复性和规模化生产。相反，批量法缺乏均一性，而传统挤出仍为劳动密集型的间歇式工艺。本研究报道了一种将可重复使用的3D打印毫流控混合器与在线膜挤出相整合的连续合成平台。通过在毫尺度上设计稳健的3D内部结构，该系统实现了快速混合，同时降低了与微通道相关的堵塞风险。该平台提供了耐用、易清洁的替代方案，增强了工艺可重复性；其集成化设计实现了LNPs的单通精制，简化了生产流程，可在高达20 mL min?1的流速下获得高质量、均一的LNPs。总体而言，该研究为工业LNP制造提供了一条可扩展、经济高效且抗污染的路径，克服了现有基于一次性卡盒系统的局限性。
脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs)作为小分子治疗剂和核酸递送平台的广泛应用，特别是在mRNA疫苗和基因编辑领域的核心地位，推动了对其高效制备技术的迫切需求。LNPs的合成本质上是核酸与脂质制剂在有机溶剂中通过自发自组装形成纳米颗粒的过程，其中有机相与水相的混合动力学对最终颗粒的尺寸和多分散性起着决定性作用。然而，现有技术路径均存在显著局限：传统批量混合虽简单易行，但混合场非均一，导致粒径分布宽、包封效率低；微流控技术虽能实现精准控制，却因高表面面积-体积比和低通道尺寸而易于发生前体物污染与通道堵塞，且对昂贵的单次使用芯片的依赖构成了经济瓶颈；膜挤出作为后处理手段虽可改善粒径均一性，但属于非连续的多步骤间歇操作，过程控制复杂。因此，如何兼顾精准性、可扩展性与经济性，开发统一的连续生产平台，成为LNP制造领域亟待解决的科学问题。基于此背景，研究人员在《Small》发表了这项研究，旨在通过整合可重复使用的3D打印毫流控混合器与在线膜挤出，建立一种混合型连续合成平台，以克服现有技术的局限性。
研究采用的主要关键技术方法包括：基于数字光处理（Digital Light Processing, DLP）技术的3D打印制备聚甲基丙烯酸甲酯（Poly(methyl methacrylate), PMMA）材质的毫流控混合腔室；利用COMSOL Multiphysics有限元软件进行三维数值模拟，分析不同混合单元架构下的流场与浓度场分布；采用动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）技术测定LNPs的Z-平均粒径和多分散指数（Polydispersity Index, PDI）；运用RiboGreen荧光分析法定量测定mRNA包封效率和过程收率；借助CCK-8法和活/死细胞染色法评估体外细胞相容性；利用流式细胞术和荧光显微镜观测细胞摄取与转染效率；以及通过能量色散X射线光谱（Energy-Dispersive X-ray Spectroscopy, EDXS）分析滤膜表面污染情况。
研究结果部分，"混合器架构对混合效率与LNP粒径的影响"显示，研究人员设计了1D直线型、2D平面分合式和3D立体分合式三种通道几何结构。数值模拟表明，3D通道通过使流体在交替平面中反复分裂与重新汇合，实现了远超1D和2D架构的混合加速效果，单一混合单元即可达到80%以上的混合效率，五个单元后超过99.9%。实验验证采用酵母RNA负载的LNPs，结果显示3D混合器始终产生更小粒径和更低PDI的颗粒，其中五个单元的3D混合器被选为最优配置。这一发现证实了早期混合条件对LNP质量的决定性作用。
"不同工作流程的LNP粒径与稳定性比较"部分，研究人员将3D打印混合室无在线滤膜（3DM）、有在线滤膜（3DM-F）的工作流程，与批量混合及商业化微流控平台（Ignite, NanoAssemblr, Cytiva）进行对比。结果表明，批量混合产生显著更大的粒径（~133.6 nm），而3DM与Ignite粒径相近（~100 nm）；3DM-F虽粒径略大（~108.9 nm），但在4°C储存期间表现出更优的长期稳定性。包封效率方面，3DM、3DM-F和Ignite均超过90%，3DM-F在过程收率上略有优势。研究揭示，在线挤出过滤不仅具有尺寸排阻作用，更通过高剪切力促进纳米颗粒重组织，从而改善胶体稳定性。
"不同工作流程LNPs的体外细胞学评价"部分，采用NIH-3T3成纤维细胞进行实验。所有制剂均表现出优异的细胞相容性，24小时细胞存活率大于95%。细胞摄取实验显示，3DM-F的细胞结合特性与商业化Ignite平台相当。功能评价方面，3DM-F LNPs的增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, eGFP)转染阳性细胞比例（57.02 ± 1.73%）显著高于批量混合（42.54 ± 2.19%）和3DM（49.77 ± 3.43%），达到与Ignite相当的水平。
"3D混合室的长期运行稳定性与负载多样性"部分，研究人员在20 mL min
?1流速下进行30分钟连续运行，系统稳定产生粒径约50-55 nm的LNPs，透析后PDI稳定在0.1以下。EDXS分析显示滤膜表面仅有痕量核酸残留，无LNP组分堵塞孔道的证据。经过五次清洗循环重复使用，LNPs的粒径和PDI仍保持高度均一。此外，该平台成功制备了负载酵母RNA、eGFP mRNA、聚腺苷酸（Polyadenylic acid, Poly(A)）和聚肌苷酸-聚胞苷酸（Polyinosinic-polycytidylic acid, Poly(I:C)）的LNPs，包封效率均大于90%，展现出良好的负载多样性。
讨论部分，研究综合分析了高效初始混合与后续剪切介导重组织的协同作用机制，强调两者缺一不可——3DM-F策略通过优化这一组合，同时实现了与商业化微流控平台相当的性能表现和更优的经济性与可扩展性。研究人员特别指出滤膜材料（如聚四氟乙烯(Polytetrafluoroethylene, PTFE)与聚醚砜(Polyethersulfone, PES)）对颗粒尺寸的潜在影响，以及系统向HPLC泵驱动的完全连续操作扩展的可行性。
结论部分翻译如下：本研究中，研究人员通过整合3D打印毫流控混合器与连续在线挤出，建立了一种可扩展的无芯片LNP制造策略。数值模拟和实验验证表明，相较于1D和2D设计，3D分合式架构显著加速了早期阶段混合，能够形成更小、多分散性更低的LNPs，并确定五个单元的3D混合器为最优构型。与常规工作流程的基准比较揭示，手动批量混合产生无法被下游过滤完全精制的非均一、过大预混物；而无过滤3D打印混合（3DM）虽可获得与商业化微流控平台（Ignite）相当的粒径，但长期储存稳定性降低。重要的是，整合在线过滤（3DM-F）改善了过程收率和储存稳定性，同时保持高包封效率（>90%），这一优势转化为更优越的体外性能表现。研究人员证明，3DM-F LNPs具有优异的细胞相容性，其细胞结合能力及转染效率高于批量混合和3DM，性能与商业化微流控混合器相当。此外，连续运行实验表明，该系统可持续产生50-80 nm、低PDI的LNPs，滤膜孔道阻塞证据极少，且对多种核酸负载均能实现稳健包封，支持运行的耐久性与负载的多样性。因此，这些结果表明，高质量LNP生产既需要高效的初始混合以产生良好控制的预混物，也需要过滤过程中剪切介导的重组织步骤。总体而言，研究人员认为，基于3D打印混合器的架构为经济、可扩展的LNP制造提供了有前景的策略，具有面向生物医学应用的模块化适应性，可根据特定制剂需求进行优化。
