整合液相色谱–高分辨质谱（LC–HRMS）与计算机预测（In Silico Prediction）发现一种体内羟基化原人参三醇（Protopanaxatriol, PPT）代谢产物并具有增强的抗炎活性

《Journal of Ginseng Research》：Integrated LC–HRMS and In Silico Prediction Discovery a Hydroxylated Protopanaxatriol Metabolite In Vivo with Enhanced Anti-inflammatory Activity

　　

背景：原人参三醇（Protopanaxatriol, PPT）是人参皂苷的关键苷元，具有显著抗炎潜力但口服生物利用度低。经口给药后，PPT可被胃酸、肠道菌群及肝酶转化为生物活性增强的代谢物。方法：研究人员采用整合代谢组学策略，联合液相色谱–高分辨质谱（Liquid Chromatography–High Resolution Mass Spectrometry, LC–HRMS）、计算机预测（in silico prediction）及分子网络（Molecular Networking），系统表征脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）诱导的小鼠急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）模型中PPT的代谢产物，并对血清、尿液及粪便样本中的代谢物进行鉴定。结果：共鉴定出20种代谢产物，包括首次发现的新型代谢物25-羟基-PPT（25-hydroxy-PPT, 25OH-PPT）。体外机制实验表明，25OH-PPT仅在模拟胃液条件下经酸催化非酶促羟化途径生成。功能评价显示25OH-PPT的抗炎活性显著强于PPT（RAW 264.7细胞中抑制一氧化氮生成的半数抑制浓度IC50分别为1.52 μM vs. 40.34 μM）。结论：上述发现揭示了PPT新的代谢活化途径，为其药理作用机制提供见解，并为基于PPT的治疗药物设计提供了新思路。

论文解读：整合LC–HRMS与In Silico预测发现体内羟基化原人参三醇代谢产物25OH-PPT及其增强抗炎活性

人参皂苷是人参（Panax ginseng）、三七（Panax notoginseng）及西洋参（Panax quinquefolius）的主要活性成分，依据苷元结构可分为原人参二醇型（Protopanaxadiol, PPD型）、原人参三醇型（Protopanaxatriol, PPT型）、齐墩果烷型（Oleanane-type, OA型）及拟人参萜醇型（Ocotillol-type, OT型），其中PPT型人参皂苷（如Re、Rg₁、Rf、Rh₁、Rg₂）在胃肠道最终代谢为原人参三醇（Protopanaxatriol, PPT, C₃₀H₅₂O₄），具有明确的神经保护、抗氧化及抗炎活性，在急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）及急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome, ARDS）治疗中有应用前景。然而广泛药代动力学研究表明PPT口服生物利用度极低（通常<5%），限制了其制剂开发及临床应用。天然化合物经口摄入后可被胃酸、肠道菌群及肝酶转化生成结构不同、吸收改善且潜在生物活性增强的代谢物，因此研究人员假设PPT经口给药后在ALI模型中所产生的治疗作用不完全由PPT本身介导，而主要由体内生成的高活性代谢产物介导。既往虽对正常大鼠或小鼠中PPT体内代谢有所研究，但炎症状态可显著改变胃内酸度、肠道菌群组成及代谢酶表达水平，导致活性代谢物的种类及丰度与正常状态存在根本差异，而炎症如ALI条件下PPT的代谢轮廓尚未明确，制约了对其实效物质基础的理解。为此，研究人员建立整合液相色谱–高分辨质谱（Liquid Chromatography–High Resolution Mass Spectrometry, LC–HRMS）、计算机预测（in silico prediction）及分子网络（Molecular Networking）的分析策略，在LPS诱导的ALI小鼠模型中系统研究PPT体内代谢谱，鉴定关键代谢物并阐明其生物转化途径，比较代谢物与原型PPT的生物活性以揭示PPT发挥疗效的真实活性物质，为基于活性代谢物的ALI新药研发奠定基础。本研究发表于《Journal of Ginseng Research》。

主要关键技术方法：

研究人员采用LPS诱导的SPF级雄性C57BL/6J小鼠ALI模型（n=6/组，给药组灌胃PPT 100 mg·kg^-1，模型对照组给予LPS 5 mg·kg^-1），收集不同时间点血清、尿液及粪便样本。建立包含文献报道及BioTransformer与Gloryx平台预测的PPT虚拟代谢物自定义数据库；采用MS-DIAL进行LC–HRMS（UPLC-Q/TOF–MS，电喷雾电离负离子模式，DIA模式m/z 50–1500）数据峰检测、MS/MS去卷积、代谢物注释及峰对齐；将对齐峰表及去卷积MS/MS谱导入全球天然产物社会分子网络（Global Natural Products Social Molecular Networking, GNPS）平台构建分子网络，基于精确质量匹配、MS/MS相似度、合理代谢质量偏移及空白对照过滤鉴定代谢物。通过模拟唾液、不同pH模拟胃液（含/不含胃蛋白酶）、肝微粒体及ALI小鼠盲肠内容物厌氧孵育体系探究25OH-PPT生成机制。实验室合成25OH-PPT并经NMR确证；采用RAW 264.7巨噬细胞LPS诱导炎症模型，CCK-8法检测细胞活力、Griess试剂测定上清NO（一氧化氮）含量并计算IC₅₀；分子对接（AutoDock Vina，靶标iNOS PDB ID: 3NW2）及100 ns全原子分子动力学模拟（GROMACS, CHARMM36力场）评估结合稳定性。尾静脉注射PPT组验证25OH-PPT是否为胃内酸性非酶促转化产物。

研究结果

3.1. Construction of a custom database for PPT metabolites

研究人员通过检索Web of Science和PubMed整理48个已报道PPT代谢物，结合BioTransformer和Gloryx预测94个虚拟代谢物，整合Phase I/II常见转化反应及特征碎片离子（如m/z 391对应C20–C21键断裂特征碎片），构建并合并为MSP格式自定义PPT代谢物数据库用于后续注释。

3.2. Focusing metabolites based on MS-Dial and GNPS metabolic networks

UPLC–Q/TOF–MS分析ALI小鼠血清、尿、粪样本，经MS-DIAL与自定义库匹配初筛目标离子（粪401/6378、尿319/5345、血清344/5716），导入GNPS构建分子网络并依内源性背景分布过滤，排除不符已知代谢转化的Δm/z边，最终从粪、尿、血清中分别鉴定候选代谢物32、26和20个。

3.3. The identification of PPT metabolites

通过分析分子网络中节点MS/MS谱并结合CFM-ID碎片模拟确认结构。PPT准分子离子[M–H]^?m/z 475.3772，特征碎片m/z 391.2822（C20–C21断裂）。代谢物M2准分子离子m/z 493.3937（较PPT+18 Da，加氧羟化），具相同特征碎片m/z 391.2873，表明羟化发生于C20侧链C24=C25双键且遵从马氏规则优先在C25位，鉴定为25-羟基-PPT（25OH-PPT, C₃₀H₅₄O₅），与实验室硫酸催化合成并NMR确证的25OH-PPT对照品保留时间、分子离子及碎片一致。共鉴定20个代谢物——18个I相代谢物（脱氢、单氧化、双氧化、三氧化等）及2个II相代谢物（半胱氨酸结合及葡萄糖醛酸化），其中8个见于血清、18个见于粪便、4个见于尿液。

3.4. Anti-inflammatory evaluation of PPT and its metabolites via molecular docking

因多数代谢物体内丰度低且无对照品无法全面体外验证，研究人员以诱导型一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase, iNOS, PDB ID: 3NW2）为靶点做分子对接预测，25OH-PPT结合能较低、结合亲和力较强，可形成稳定氢键及疏水相互作用，其余代谢物结合较弱，提示25OH-PPT为重要候选活性代谢物。

3.5. In vitro biomimetic verification of the generation mechanism of 25OH-PPT

PPT分别在模拟唾液液、不同pH模拟胃液（含/不含胃蛋白酶）、模拟肠液及小鼠肝微粒体中孵育，25OH-PPT仅在模拟胃液中检出，唾液、肠液及肝微粒体系统未见。进一步在人工胃液中发现：pH 7.5几乎无25OH-PPT生成，pH 1.2–2.0明显生成且随酸度增强生成增多，pH≥3.0生成显著减少近至消失；加或不加胃蛋白酶均产25OH-PPT；pH 1.5下随孵育时间延长PPT递减、25OH-PPT递增。表明25OH-PPT由胃内强酸催化、非酶促侧链C25羟化反应生成。

3.6. Verification of the PPT conversion pathway via tail vein injection

ALI小鼠尾静脉注射PPT后，血清、尿、粪中均未检出25OH-PPT；同等剂量下经口给药比静脉给药肺组织HE染色显示更显著的炎症减轻，进一步证实25OH-PPT为经口摄入时胃内酸性环境非酶促转化特有产物，且其生成与口服PPT抗炎效价相关。

3.7. Comparison of the pharmacological activities of PPT and 25OH-PPT

合成25OH-PPT对照品处理LPS刺激的RAW 264.7细胞，PPT及25OH-PPT在测试浓度下均无细胞毒性；25OH-PPT浓度依赖抑制LPS诱导NO释放，IC₅₀=1.52 μM，显著低于PPT（IC₅₀=40.34 μM）。分子动力学显示25OH-PPT–iNOS复合物RMSD更低、构象波动更小、氢键数目更稳定，表明结合更稳定，支持其抗炎活性增强。C25位引入羟基改善分子极性、氢键供受能力并降低过高亲脂性，预测水溶性及小肠吸收略优于PPT，游离药物比例可能增加，共致抗炎活性提升。

讨论与结论翻译

本研究建立自定义PPT代谢物数据库并结合MS-DIAL与分子网络分析，系统表征ALI小鼠中PPT代谢产物，首次发现并确证新型活性代谢物25OH-PPT。进一步研究表明25OH-PPT主要在胃强酸环境下经非酶促羟化生成，而非肝微粒体或肠道菌群酶催化；25OH-PPT抗炎活性显著高于原型PPT。该发现揭示了PPT新的胃酸性代谢活化途径，拓展了对PPT体内代谢轮廓的认识，为理解其药理效应提供机制依据，并为后续PPT衍生物结构设计、制剂开发及药效物质基础研究提供新实验基础。局限性包活未完全阐明25OH-PPT增强抗炎的具体分子通路及直接靶点，且其实际体内药代动力学、组织分布、血药浓度–时间曲线及代谢稳定性尚需系统研究。

结论：这些发现揭示了PPT的一条新代谢活化途径，为其药理作用机制提供了见解，并为设计基于PPT的治疗药物提供了新视角。