吲哚-3-丙酮酸靶向递送抑制巨噬细胞铁死亡以增强膀胱癌CD8+ T细胞介导的免疫治疗应答

《Advanced Science》：Targeted Delivery of Indole-3-Pyruvic Acid Suppresses Macrophage Ferroptosis to Enhance CD8+ T Cell-Mediated Immunotherapy Response in Bladder Cancer

　　

肿瘤内微生物群相关代谢物正成为肿瘤免疫的新兴调控因子，但其治疗潜力仍有待探索。在本研究中，吲哚-3-丙酮酸（indole-3-pyruvic acid, I3P）——一种与乳酸菌相关的色氨酸代谢物——被鉴定为与膀胱癌（bladder cancer, BCa）免疫治疗应答相关的分子。从机制上讲，I3P通过AHR–NF-κB–SLC7A11信号轴抑制巨噬细胞铁死亡（ferroptosis）并维持CD8⁺ T细胞活性，从而维持巨噬细胞的氧化还原稳态。AHR或NF-κB信号的破坏会消除这些效应。值得注意的是，脂质体递送I3P能够实现对肿瘤相关巨噬细胞的高效靶向，并在无明显毒性的情况下增强免疫治疗应答。综上所述，这些发现将I3P鉴定为一种增强抗肿瘤免疫的免疫调节代谢物，并支持纳米颗粒介导的递送作为膀胱癌免疫治疗敏化的一种有前景的策略。

该论文发表于《Advanced Science》，研究团队围绕肿瘤微生物群代谢物与免疫治疗应答的关联展开研究。肿瘤免疫微环境（tumor immune microenvironment, TIME）的复杂性导致免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）治疗应答存在显著异质性，膀胱癌虽对免疫治疗较为敏感，但患者间疗效差异明显，亟需阐明调控免疫治疗应答的关键机制。近年研究发现宿主微生物群通过调节TIME参与肿瘤进展和治疗应答，其中微生物衍生代谢物是关键功能介质。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）因其丰度和可塑性成为响应微生物信号的重要细胞群体。铁死亡作为铁依赖性脂质过氧化驱动的细胞死亡形式，日益被视为调控免疫细胞功能和肿瘤免疫应答的关键因素，但微生物衍生代谢物能否通过调控巨噬细胞铁死亡来激活抗肿瘤免疫尚不清楚。在此背景下，研究人员鉴定出色氨酸代谢物I3P为免疫刺激分子，并开发巨噬细胞靶向纳米递送系统以增强其在膀胱癌中的免疫治疗敏化效果。

该研究主要运用了以下关键技术方法：利用自发性和原位膀胱癌小鼠模型构建免疫治疗应答差异分组，结合16S rRNA测序与靶向代谢组学分析肿瘤微生物群与代谢物差异；通过单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）解析免疫微环境细胞组成及细胞死亡通路变化；运用骨髓源性巨噬细胞（bone marrow-derived macrophages, BMDMs）体外培养体系进行分子机制验证，包括CETSA（cellular thermal shift assay）检测蛋白靶点结合、分子对接模拟配体-受体相互作用、基因沉默与过表达干预，以及流式细胞术、共聚焦显微镜和透射电镜（transmission electron microscopy, TEM）等多维度功能评估；构建甘露糖修饰的脂质体纳米递送系统（Nano@I3P）实现巨噬细胞靶向；并在临床膀胱癌患者样本队列（中山大学孙逸仙纪念医院，SYSMH队列）中进行代谢组学验证关联分析。

研究结果部分涵盖以下关键发现：

"Intratumoral Bacterial Metabolite I3P Is Associated with Immunotherapy Response in Bladder Cancer"：研究人员通过抗PD-1抗体治疗自发性膀胱癌模型，发现应答者肿瘤免疫浸润更强、负荷更低。原位膀胱癌模型的荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization, FISH）显示应答者与非应答者细菌信号存在差异。16S rRNA测序的主坐标分析（principal coordinates analysis, PCoA）揭示两组微生物组成部分分离，功能富集分析显示氨基酸代谢通路差异显著，其中乳杆菌属（Lactobacillus）在应答组富集。靶向代谢组学进一步发现仅I3P在应答组显著升高，而犬尿氨酸和羟色氨酸无显著差异。抗生素清除实验证实I3P主要来源于肿瘤相关微生物群。口服I3P可显著抑制皮下膀胱癌模型肿瘤生长，增加GZMB⁺和IFN-γ⁺ CD8⁺ T细胞比例，但I3P对MB49细胞系的克隆形成、迁移和划痕愈合无显著影响，提示其不直接作用于肿瘤细胞。临床队列分析显示应答者尿I3P水平显著高于非应答者，确立I3P与膀胱癌免疫治疗应答的正向关联。

"I3P Exerts Anti-Tumor Effects by Suppressing Macrophages Ferroptosis"：流式细胞术显示I3P处理组免疫细胞活性广泛增强。对CD45⁺细胞的scRNA-seq分析发现I3P显著增加肿瘤内巨噬细胞比例。ssGSEA（single-sample Gene Set Enrichment Analysis）显示I3P处理后铁死亡通路变化最为显著，且巨噬细胞在所有免疫亚群中表现出最高的铁死亡活性，I3P处理后该活性显著降低。亚群分析显示高铁死亡活性的Mac_Spp1亚群减少，而免疫激活型Mac_Cd86亚群增加。体外实验中，I3P显著增强BMDMs对RSL3和IKE诱导的铁死亡的抵抗性，降低脂质过氧化水平和亚铁离子积累，TEM显示I3P逆转了RSL3诱导的线粒体皱缩和嵴消失等铁死亡形态学特征。临床样本的多重免疫荧光（multiplex immunofluorescence, mIF）证实应答者中铁死亡巨噬细胞比例更低。功能上，I3P恢复了RSL3损伤的巨噬细胞吞噬功能和抗原加工呈递能力，而巨噬细胞耗竭实验表明I3P的抗肿瘤效应依赖于巨噬细胞存在。

"Suppression of Macrophage Ferroptosis by I3P Sustains CD8⁺ T Cell Activation"：CellChat分析显示I3P增强了巨噬细胞与CD8⁺ T细胞间的通讯。来自I3P预处理巨噬细胞的条件培养基可显著降低CD8⁺ T细胞的脂质过氧化水平，维持其线粒体活性氧（reactive oxygen species, ROS）稳态，并恢复RSL3抑制的GZMB和IFN-γ表达及肿瘤杀伤能力。体内巨噬细胞耗竭实验证实I3P对CD8⁺ T细胞的效应激活依赖巨噬细胞。IKE联合/单独处理实验显示I3P在铁死亡应激下显著抑制肿瘤生长，且巨噬细胞与CD8⁺ T细胞呈现协调的铁死亡变化趋势。

"I3P Suppresses Macrophages Ferroptosis Through AHR"：分子对接显示I3P可结合芳烃受体（aryl hydrocarbon receptor, AHR）的预测配体结合区，CETSA证实I3P改变了AHR的热稳定性。scRNA-seq显示巨噬细胞中Ahr表达最高，且Ahr高表达亚群铁死亡富集较低。mIF证实AHR在肿瘤相关巨噬细胞中显著富集。AHR药理学抑制剂（BAY218、SR-1）和siRNA沉默均 abolished I3P的抗铁死亡效应和吞噬功能恢复作用，确立AHR为I3P的关键介质。

"I3P Activates AHR-Dependent NF-κB Signaling to Promote SLC7A11 Transcription"：转录组学的GO分析（Gene Ontology enrichment analysis）和GSEA（Gene Set Enrichment Analysis）将NF-κB通路鉴定为I3P处理后的显著富集通路。Western blot显示I3P增强IKK和p65磷酸化，该效应被AHR抑制所阻断；共聚焦成像证实p65核转位增强。NF-κB抑制剂BAY 11-7082显著削弱I3P的抗铁死亡效应、吞噬功能恢复作用及体内抗肿瘤效果，并逆转I3P诱导的巨噬细胞和CD8⁺ T细胞脂质过氧化抑制及CD8⁺ T细胞效应功能增强。差异基因分析中Slc7a11为最强上调的铁死亡相关基因，其编码的溶质载体家族7成员11（SLC7A11，即xCT，胱氨酸/谷氨酸转运体亚基）表达受I3P诱导且依赖AHR-NF-κB通路。SLC7A11敲低显著削弱I3P的抗铁死亡效应，I3P处理提高GSH/GSSG比值（谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽），而NF-κB抑制逆转该效应，完整建立AHR–NF-κB–SLC7A11信号轴。

"Macrophage-Targeted Nanodelivery Potentiates the Immunoregulatory Activity of I3P"：研究人员构建甘露糖修饰的脂质体纳米平台（Nano@I3P），动态光散射显示平均粒径140 nm，PDI为0.17，zeta电位-12.63 ± 4.65 mV，包封率56.5%，载药量11.30%，体外呈现缓释特性。流式细胞术证实Nano@I3P被肿瘤相关巨噬细胞优先摄取。与游离I3P相比，Nano@I3P更有效地抑制巨噬细胞脂质过氧化、线粒体ROS和Fe²⁺积累，更强效恢复吞噬功能，并通过条件培养基更有效降低CD8⁺ T细胞脂质过氧化和增强肿瘤杀伤能力。

"Nanoparticle-mediated Delivery of I3P Overcomes Resistance to Anti-PD-1 Therapy"：体内分布实验显示Nano@I3P肿瘤蓄积显著高于游离I3P。在经三轮体内ICB建立的耐药模型中，Nano@I3P单药显著抑制肿瘤，与抗PD-1联合治疗进一步克服耐药性，且无明显体重下降或主要器官组织损伤。流式和mIF显示Nano@I3P增加免疫浸润，提升CD8⁺ T细胞比例，降低巨噬细胞和CD8⁺ T细胞的铁死亡应激。BBN诱导的自发性膀胱癌模型中，联合治疗实现最显著的肿瘤抑制。

讨论部分，研究人员指出该研究揭示了膀胱癌中具有机制洞察和转化价值的微生物相关免疫通路。I3P作为乳杆菌关联代谢物在ICB应答肿瘤中富集，通过抑制巨噬细胞铁死亡维持其免疫支持功能。该发现扩展了AHR在肿瘤免疫中的背景依赖性认识，显示I3P-AHR信号在膀胱癌中激活AHR-NF-κB-SLC7A11程序以维持免疫治疗下的氧化还原稳态。针对TAMs功能异质性和适应性难题，代谢调节提供了可行的重编程策略。Nano@I3P通过甘露糖修饰实现巨噬细胞优先靶向，增强肿瘤蓄积和治疗效果，与抗PD-1治疗产生协同效应且无显著毒性。研究局限性包括：具体产生I3P的微生物物种和代谢通路尚待明确；TIME中其他细胞成分的作用需进一步研究；临床转化潜力有待后续验证。

研究结论翻译：本研究将I3P鉴定为膀胱癌中微生物来源的抗肿瘤免疫调控因子。通过AHR–NF-κB–SLC7A11轴抑制巨噬细胞铁死亡，I3P维持CD8⁺ T细胞效应功能并增强免疫治疗应答。I3P的脂质体递送进一步支持其作为膀胱癌免疫治疗敏化策略的潜力。