线粒体靶向的F16衍生物：一种新合成方法及其光活性性质

《Journal of Photochemistry and Photobiology》：Mitochondria-targeted F16 derivatives: a new synthetic approach and photoactive properties

　　

研究人员开发了一种合成F16衍生物的新策略，该策略基于吡喃鎓盐（pyrylium salt）与吲哚-3-甲醛的缩合反应，随后与胺类反应生成目标吡啶鎓盐（pyridinium salt）。与传统F16合成方法依赖于预先合成的吡啶化合物不同，该方法允许在吡啶环上引入任意芳香族和/或脂肪族取代基，从而实现结构多样化。所得化合物19a-d含有苯基取代的吡啶环，并表现出双态发射（dual-state emission, DSE）特性：其在溶液中的荧光量子产率极低（?f ≤ 0.004），但在固态下量子产率显著提高（?f = 0.023–0.045），提示其在聚集态或膜结合系统中具有成像应用潜力。此外，这些F16衍生物还表现出光致变色（photochromism）行为，即光诱导的E/Z异构化反应，使其可作为荧光分子开关。化合物19d的光学性质使其能够用于评估分离线粒体的膜电位，并通过荧光显微镜观察其在活细胞线粒体中的积累。研究人员还比较了新合成的亲脂性阳离子与已知文献中的阳离子在跨膜电位驱动下透过人工脂质双层膜的能力差异。

线粒体靶向的荧光探针在现代医学诊疗一体化（theranostics）中具有重要价值，因其能够同时实现疾病诊断与治疗监测。线粒体功能障碍与神经退行性疾病、心血管疾病及代谢紊乱密切相关，而线粒体靶向分子因其能穿透膜结构并响应内膜电位差，成为研究热点。F16，即(E)-4-(1H-吲哚-3-基乙烯基)-N-甲基吡啶鎓碘化物，是一种选择性积累于癌细胞线粒体并具有广谱抗增殖活性的化合物，但其结构修饰研究多集中于吲哚片段或构建杂化结构，吡啶环本身鲜有改变。传统F16合成依赖预先存在的吡啶化合物，限制了吡啶环的多样化。此外，F16衍生物的光引发过程特性（如双态发射和光致变色性）及其跨膜渗透性尚不明确，这些问题制约了其在生物成像中的应用。为此，研究人员开展了本项研究，旨在开发基于吡喃鎓盐的新型合成策略，系统探究所得化合物的光物理性质、光化学行为及其在线粒体成像和膜电位监测中的应用潜力。该论文发表于《Journal of Photochemistry and Photobiology》。

研究人员采用的关键技术方法包括：有机合成方法学，以吡喃鎓盐为起始原料，通过序列缩合反应构建2,6-二苯基取代的F16衍生物；光谱学表征，利用紫外-可见吸收光谱、荧光光谱及绝对荧光量子产率测定仪测定化合物的光物理性质；密度泛函理论（DFT）计算与时间依赖密度泛函理论（TD-DFT）计算，采用M06-2X/Def2-TZVP方法优化分子结构并模拟电子跃迁性质；荧光显微镜成像，使用MRC-5细胞系与MitoTracker Deep Red商业探针进行共定位分析；线粒体膜电位测量，以分离的大鼠肝线粒体为样本，监测染料吸收光谱变化；平面双层脂质膜（BLM）电生理技术，测定亲脂性阳离子的跨膜渗透性。

合成2,6-二苯基取代的F16类似物

研究人员开发了基于吡喃鎓盐制备吡啶鎓阳离子的新方法。4-乙基-2,6-二苯基-4H-吡喃（15）与三苯甲基高氯酸盐反应生成盐16，再与1-甲基-1H-吲哚-3-甲醛（17）缩合得到含吲哚片段的高氯酸盐18。吡喃鎓盐18与多种胺类（含二甲氨基的乙二胺衍生物、吗啉基乙胺、色胺及乙醇胺）反应，制得目标化合物19a-d。该策略的核心优势在于吡啶鎓阳离子在反应中构建，而非使用预先存在的吡啶化合物，从而可在吡啶环上引入多样化取代基。所选胺类残基为已知药效基团，其中弱碱性基团可增强分子亲水性以促进细胞渗透。产物结构经¹H NMR、¹³C NMR和高分辨质谱确证。基于双键甲基取代基的空间位阻及文献 precedent，化合物被指定为E构型，且DFT计算证实E-异构体具有最高热力学稳定性。

光谱研究结果

吡喃鎓盐18在乙腈中的长波吸收位于569 nm，而吡啶鎓阳离子19a-d的长波吸收发生显著蓝移（109–111 nm）至458–460 nm区域，摩尔消光系数提升（31300–42600 M^?1cm^?1），短波吸收位于282–293 nm。在乙腈溶液中，19a-d的荧光发射峰位于595–599 nm，斯托克斯位移为4885–5045 cm^?1，但荧光量子产率极低（?f ≤ 0.004）。R取代基的性质对光谱影响不显著。

光引发过程研究——双态发射特性

吡啶鎓盐19a-d在固态下表现出显著增强的荧光量子产率（?f = 0.023–0.045），较溶液态提高约一个数量级，此现象归因于聚集诱导发射（aggregation-induced emission, AIE）效应。其固态发射光谱较溶液态红移24–87 nm，且发射延伸至700–800 nm近红外-I区（NIR-I: 650–950 nm），有利于生物组织穿透成像。吡喃鎓盐18在固态下无荧光。尽管溶液态的低量子产率限制了活细胞荧光显微镜应用，但固态/聚集态的高发光效率使这类化合物在聚集或膜结合系统研究中具有价值。

光引发过程研究——光致变色转化

吡啶鎓盐19a-d的乙腈溶液表现出可逆光致变色行为。以405 nm光照射19a溶液时，长波吸收带（459 nm）强度下降，同时在250–340 nm和525–575 nm区域吸收增强，出现两个等吸收点（342 nm和521 nm），表明发生单分子光反应生成光产物X。停止照射后发生热弛豫，但光谱无法完全恢复至初始状态，提示溶液中存在E–X平衡。进一步研究发现，436 nm光照和365 nm光照可使体系达到不同比例的光稳态，且光稳态间转换具有良好的可重复性，表明该类化合物可作为荧光开关。伴随吸收光谱变化，荧光强度亦可被光调制，有利于超分辨显微成像应用。研究人员推测X产物为Z-异构体，系C=C键的热可逆Z→E光异构化所致，但因缺乏直接结构证据（如光稳态NMR或HPLC分析），该解释尚存不确定性。

量子化学计算

研究人员对19d的E/Z异构化进行了气相DFT计算（M06-2X/Def2-TZVP水平）。两种异构体中苯基取代基均呈螺旋桨式排布，这是Katritzky盐的典型特征。在乙腈中，E-型比Z-型稳定3.1 kcal/mol（含零点能校正为2.5 kcal/mol），MP2//HF计算进一步验证此结论（ΔE = 1.8 kcal/mol）。E-型中苯环与吡啶鎓平面二面角为68.5°和68.0°，Z-型中为58.0°和75.0°，这种空间位阻阻止了分子在凝聚态中的近距离π,π-堆积，从而使发光机制局限于吲哚-吡啶鎓片段内的分子内过程。HOMO-LUMO分析表明激发态为π,π^*性质，且R取代基及螺旋桨式苯基对前线轨道贡献可忽略。S₀态C=C旋转能垒为31.7 kcal/mol，S₁态仅为1.9 kcal/mol，而Z→E热反应能垒为28.6 kcal/mol；激发态中异构体相对稳定性发生反转。E-型的吲哚-吡啶鎓片段近乎共面（二面角5.3°），而Z-型该角度增至9.2°，显著削弱共轭与分子内电荷转移能力，导致Z-型经非辐射跃迁返回基态，解释了其荧光猝灭及溶液态低量子产率。此外，自然电荷分析揭示正电荷分布于吡啶鎓环α-和γ-位碳原子及氢原子组成的"氢壳层"中，而非经典结构式所示的氮原子上。

与活细胞及分离线粒体的相互作用

研究人员选取化合物19d评估其亚细胞定位。人MRC-5细胞与1 μM 19d孵育1小时后，荧光显微镜显示该化合物可有效穿透细胞膜，并与MitoTracker Deep Red信号高度重叠，Pearson相关系数为0.72 ± 0.076，证实其优先积累于线粒体。此外，19d可用于监测分离大鼠肝线粒体（RLM）的膜电位。以458 nm和490 nm处的吸光度差值作为指标，研究人员观察到：加入线粒体后信号上升（表明膜电位产生）；加入复合物I抑制剂鱼藤酮后去极化；加入琥珀酸后复极化；加入复合物III抑制剂抗霉素A后电位下降；加入ATP后再次极化（被寡霉素抑制）；加入解偶联剂DNP后电位进一步降低。这些动态变化与商业探针 safranin O 的监测结果一致，证明19d可作为线粒体膜电位探针。

在平面双层脂质膜（BLM）渗透性研究中，19d和safranin O几乎不引起膜电流，而19a和TMRE（四甲基罗丹明乙酯）产生数十皮安电流。光照对19a和19d的BLM电流无显著影响，表明E/Z异构化不改变其膜渗透性。渗透系数测定结果为：TMRE（6.5×10^?5 cm·s^?1）> 19a（1.7×10^?5 cm·s^?1）> 19d（7.2×10^?7 cm·s^?1）≈ safranin O（4.5×10^?7 cm·s^?1），提示19d的膜渗透性显著低于19a。

研究结论总结如下：研究人员已开发出一种合成F16衍生物的新方法，该方法基于甲基取代的吡喃鎓盐与吲哚-3-甲醛的序列缩合，以及所得吡喃鎓盐与胺类的反应。吡喃鎓模块向吡啶鎓盐的转化允许吡啶环的多样化，这相较于依赖预先形成吡啶的传统F16合成方法具有真正优势。已确定合成的化合物19a-d具有DSE性质，使其在生物物体成像方面具有前景。F16衍生物的光致变色反应与其中一种异构体的荧光同时存在，使其可作为荧光开关。已证明合成的F16衍生物在培养的人细胞中积累并染色细胞内的线粒体，即其在细胞线粒体中定位。19d的光学性质可用于监测分离线粒体系统中的膜电位。类似于safranin O染料，可以假设其在膜电位激发时以高浓度积累于线粒体中，导致其聚集和吸收光谱变化，从而能够记录线粒体悬液中膜电位的产生和下降。研究还证明了新合成的亲脂性阳离子在跨膜电位作用下透过人工脂质双层膜的渗透能力，其中TMRE渗透性最高，其次为19a，而safranin O和19d的渗透性显著较弱；此外，19a的异构化对其渗透能力影响可忽略不计。