《Aging Cell》：Interplay of the ENS and Microbiota With Murine Gut Epithelium-Derived Organoids in Aging
编辑推荐：
肠道是最早出现衰老征象的器官之一，表现为细胞改变、微生物群转移及再生能力下降。肠道的不同组分——如直接暴露于多种宿主-微生物互作的上皮、微生物群本身以及其下方的肠神经系统（ENS)——可能以不同方式促进衰老。理解其各自及交互作用对于阐明肠道衰老机制至关重要。为
肠道是最早出现衰老征象的器官之一，表现为细胞改变、微生物群转移及再生能力下降。肠道的不同组分——如直接暴露于多种宿主-微生物互作的上皮、微生物群本身以及其下方的肠神经系统（ENS)——可能以不同方式促进衰老。理解其各自及交互作用对于阐明肠道衰老机制至关重要。为更好地理解各组分对肠道衰老的贡献，研究人员通过两种小鼠品系分析肠道组织特征，并将这些参数与结肠类器官的组成及基因表达水平进行比较：抗衰老的SAMR1品系和表现出加速衰老表型的SAMP8品系。本研究证明，源于这些小鼠的结肠类器官保留了结肠组织的年龄相关特征，包括形态和细胞组成的改变。此外，将肠神经系统引入类器官培养后发现，上皮年龄对衰老表型的影响比支配组织的年龄更为显著。有趣的是，成功向类器官递送粪便提取物揭示，来自衰老动物的肠道微生物群代谢产物可在体外诱导肠道上皮的衰老表型。总之，研究结果表明衰老对肠道上皮的影响及其与神经系统和微生物群的交互作用，这可能为未来通过调控肠道共生菌来延缓肠道衰老提供新策略。
该研究发表于《Aging Cell》，旨在探究肠道组织在衰老过程中的变化规律，并明确肠神经系统（ENS)和肠道微生物群对肠道衰老的独特贡献。肠道作为最早显现衰老征象的器官之一，其各组分包括上皮屏障、免疫系统、肠神经系统及血管系统均随年龄增长发生显著改变，然而在活体生物中单独研究这些因素极具挑战性。现有类器官模型虽能代表肠道上皮，但无法涵盖与ENS及微生物群的直接互作，且尚未有研究综合评估衰老对肠道上皮和ENS的共同影响，或衰老对微生物群与肠道上皮直接作用的影响。因此，研究人员采用抗衰老的SAMR1小鼠和加速衰老的SAMP8小鼠作为模型，比较年轻（3月龄）与衰老（10月龄）动物的肠道细胞异质性和功能特性。
研究主要运用了以下关键技术方法：利用SAMR1和SAMP8两种小鼠建立衰老模型；通过苏木精-伊红（H&E)染色、阿尔新蓝染色及免疫荧光染色进行组织学与细胞组成分析；建立并培养结肠类器官及肠神经系统-类器官共培养系统；采用纵向肌层/肌间神经丛（LMMP)外植体"印章样"培养法获取ENS细胞；通过微注射技术将粪便水（FW)引入类器官以模拟微生物群代谢产物作用；运用逆转录定量PCR（RT-qPCR)检测基因表达；借助质谱蛋白质组学分析差异丰度蛋白（DAPs)；采用跨上皮电阻（TEER)测量评估屏障功能；利用IncuCyte活细胞成像系统追踪单克隆类器官生长动态；通过乙酰胆碱酯酶（AChE)和胆碱乙酰转移酶（ChAT)活性测定评估ENS功能。
**3.1 结肠组织年龄相关变化在结肠类器官中得以保留**
研究人员首先验证了结肠类器官能否反映供体动物的衰老表型。组织学分析显示，衰老SAMP8小鼠结肠隐窝伸长，杯状细胞增多，内分泌细胞（嗜铬粒蛋白A，Chga标记)减少，增殖标志物Ki67降低。类器官层面，SAMP8小鼠类器官形成效率下降，干细胞标志物Lgr5和Ki67表达降低，而杯状细胞标志物Muc2和肠细胞标志物Krt20表达升高，Chga减少，免疫组化证实杯状细胞增加、内分泌细胞和增殖减少。这些结果表明类器官保留了组织的年龄相关特征。
**3.2 肠道衍生类器官的蛋白质组学特征**
蛋白质组学分析鉴定出约90个DAPs，其中约60%在两个年龄组中表现出相似趋势。SAMP8来源类器官中抗菌肽（如α-防御素Defa11、Defa-rs2、Defa20、Defa21)、ABC转运蛋白家族（Abcb1a、Abcb1b、Abcb11)、免疫应答蛋白如主要组织相容性复合体（MHC)蛋白（H2-D1)和半乳凝素（Lgals2、Lgals9)等丰度增加。炎症相关蛋白Gvin1和Iap上调。富集分析显示免疫应答、缺氧应激和脂质代谢通路改变。岩藻糖基转移酶Fut2在SAMP8两个年龄组中均上调，而Fut4在衰老SAMP8中升高，Western blot验证了这一结果。功能上，衰老SAMP8来源类器官的TEER显著降低，表明屏障功能受损。
**3.3 观察到的表型在不同传代的类器官中表现出一定稳定性**
为探究年龄相关特征在类器官培养中的稳定性，研究人员对SAMR1衰老小鼠来源的类器官进行P1、P5和P10传代培养。IncuCyte活细胞成像显示，年轻SAMR1来源类器官生长最强，衰老SAMP8最弱，而衰老SAMR1介于两者之间；更重要的是，SAMR1衰老小鼠的P1、P5和P10代类器官生长表型无显著差异，表明年龄依赖性表型在至少10代传代中稳定维持，提示其可能由内在遗传或表观遗传因素编码。
**3.4 肠上皮年龄对ENS-类器官共培养系统的影响更大**
研究人员建立了ENS-类器官共培养系统。ENS细胞从LMMP外植体迁移并形成神经节样结构，表达神经元（β3-微管蛋白)和胶质细胞（胶质纤维酸性蛋白，GFAP)标志物。共培养结果显示：无论ENS供体年龄如何，衰老来源类器官的生长能力均显著低于年轻来源（接近减半)；年轻来源类器官与衰老ENS共培养时生长略有进一步降低，但衰老来源类器官不受ENS年龄影响。 marker基因分析中，Muc2表达在年轻与衰老类器官间存在1.7倍差异，不受ENS年龄影响；Krt20是唯一受衰老ENS影响的标志物，其在衰老ENS存在时表达增加150%，而年轻ENS仅增加50%。功能上，年轻类器官与任何年龄ENS共培养均显著提高ChAT活性；而衰老类器官则显著降低ChAT活性，并诱导AChE活性轻微升高。这些结果表明上皮年龄是决定类器官生长和ENS功能的主要驱动因素，且衰老上皮通过改变胆碱能平衡可能抑制ENS功能。
**3.5 粪便水供体年龄对结肠类器官特征的影响**
为评估微生物群代谢产物的作用，研究人员将年轻和衰老SAMR1雌性小鼠的FW微注射至年轻SAMR1来源类器官中。结果显示：衰老FW显著减小类器官面积，降低Lgr5表达，增强Krt20表达。这些表型与衰老来源类器官的观察结果高度相似，表明衰老动物来源的微生物群代谢产物足以在年轻上皮中诱导衰老样表型，包括干细胞特性降低和分化增强。
**讨论与结论**
研究表明肠道上皮是结肠衰老的关键驱动因素，其年龄相关结构和细胞表型在类器官中稳定保留，提示上皮衰老主要是细胞内在的。然而，上皮仍对微生物群代谢产物等外在信号保持高度响应性。衰老SAMP8小鼠表现出隐窝伸长和上皮增殖减少，与慢性炎症和组织更新受损一致；类器官形成效率降低和增殖标志物下降则提示干细胞功能障碍，可能与TGF-β-Smad3信号通路介导的细胞周期阻滞有关。年龄相关差异在至少10代传代中保持稳定，可能与保守的表观遗传特征如DNA甲基化模式相关。
衰老重塑了上皮谱系分配：内分泌细胞减少可能损害激素介导的代谢和上皮稳态调节，与蛋白质组学中脂质代谢通路改变相符；杯状细胞增加则可能是对炎症或微生物群失调的代偿性黏膜保护反应，与抗菌肽和MHC蛋白增加及Fut2上调一致，但伴随屏障功能受损（TEER降低)。研究开发的简化ENS分离培养方法实现了对上皮-ENS交互作用的系统研究，证实上皮年龄而非ENS年龄是决定共培养系统中类器官生长和神经递质动态的主要因素，强调了衰老上皮在塑造ENS功能中的主导作用。
研究最重要的发现之一是衰老来源的FW可在年轻上皮中复现衰老表型，这支持微生物群代谢产物作为关键外在调控因子的观点。年龄相关的短链脂肪酸（SCFAs)减少、5-羟色胺降低以及丁酸产生菌的丧失，可能共同导致肠道完整性下降和干细胞功能受损。研究将肠道上皮定位为源自内在细胞程序、微生物代谢和ENS交互作用的衰老信号的核心整合者，建立的类器官系统为研究胃肠道衰老机制和评估靶向上皮 rejuvenation、微生物代谢物或神经上皮信号通路的干预措施提供了稳健平台。研究局限性包括使用鼠源细胞的物种特异性限制、未完全定义表型丧失的确切传代节点、ENS表征的全面性不足、FW实验仅使用雌性来源类器官，以及水提取法可能遗漏疏水性化合物等。
