GM-CSF下调胶质母细胞瘤相关单核细胞中的I型干扰素应答

《Experimental & Molecular Medicine》：GM-CSF downregulates type I IFN responses in glioblastoma-associated monocytes

　　

胶质母细胞瘤（GB）是最具侵袭性的脑癌类型，预后极差。髓系细胞，尤其是单核细胞和巨噬细胞，构成GB肿瘤微环境（TME）中大多数免疫细胞，在其中促进免疫抑制微环境的形成，阻碍潜在的抗肿瘤免疫应答。I型干扰素（IFN）通常促使单核细胞和巨噬细胞向促炎方向极化，并赋予其抗肿瘤功能。利用RNA测序（RNA-seq），研究人员观察到，在与GB细胞直接细胞接触和培养基上清交换两种条件下，原代人单核细胞中的I型干扰素刺激基因（ISGs）均全局性下调，而小胶质细胞中则无此现象。令人惊讶的是，I型干扰素应答的降低并非源于干扰素-α/β受体（IFNAR）的可用性和激活变化。相反，研究人员鉴定出粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）是一种关键的GB细胞衍生因子，其通过诱导转化生长因子-β（TGF-β）信号通路，在极低浓度下降低单核细胞中的ISG表达。与此一致，人GB活检组织中I型干扰素应答基因表达与GM-CSF活性表现出互斥性。具体而言，活跃的GM-CSF信号似乎在同一个细胞以及邻近的单核细胞来源的巨噬细胞中抑制ISG表达，从而导致T细胞招募减少。总之，研究数据为迄今未知的GB中GM-CSF和TGF-β依赖的I型干扰素抑制机制提供了证据，对未来治疗策略具有潜在意义。

本研究聚焦于胶质母细胞瘤（GB）中I型干扰素（IFN）应答的调控机制，旨在揭示肿瘤微环境（TME）中免疫抑制的新途径。GB是成人最具侵袭性的脑肿瘤，中位总生存期仅15个月，标准治疗收益有限。GB的TME以髓系细胞占主导，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）构成免疫浸润的绝大多数（常超过75%），而淋巴细胞稀少。TAMs主要来源于脑驻留小胶质细胞或外周血单核细胞浸润，不同来源的TAM亚群多呈免疫抑制表型，导致免疫治疗在GB中普遍失效。I型IFN信号轴是功能型髓系抗肿瘤免疫的关键炎症通路，可诱导TAMs促炎极化、增强肿瘤细胞杀伤并促进T细胞招募。然而，GB中TAMs的I型IFN应答调控机制尚不清楚，这正是本研究的出发点。

研究人员首先通过重新分析7例初诊GB患者的单细胞RNA测序数据，发现单核细胞来源的TAMs（MO-TAMs）中I型IFN应答基因签名（ISG signature）评分较低至中等，而小胶质细胞来源的TAMs（MG-TAMs）部分亚群则显示较高表达，提示MO-TAMs中I型IFN应答受损。为探究早期肿瘤-单核细胞相互作用，研究人员从健康供体血沉棕黄层中分离原代人单核细胞，与GB细胞系LN229进行48小时直接共培养，分离单核细胞后进行RNA测序。结果显示，与IFN-β处理诱导ISGs上调相反，共培养单核细胞的基因表达谱沿主成分分析（PCA）第一主成分向相反方向偏移；共培养下调的354个差异表达基因中，22.32%为ISGs，基因本体（GO）富集分析显示抗病毒免疫应答和I型IFN信号通路特异性富集，基因集富集分析（GSEA）证实IFN-α反应基因集 depleted。进一步通过Transwell间接共培养验证，ISGs（IFIT1、OAS3、IFI44L、ISG15、IFI6、HERC5）mRNA和蛋白水平的降低主要依赖可溶性因子，且该现象在24和48小时明显，72小时部分恢复。值得注意的是，小胶质细胞系C20和HMC3与LN229共培养后ISG表达未降低，显示该效应的单核细胞特异性。多种GB细胞系（LN229、T98G、U87）均可诱导类似效应，而U251细胞不能，提示与"间充质性"TCGA亚型相关。

为鉴定关键可溶性因子，研究人员系统筛选了细胞因子谱。虽然共培养中IL-6和IL-1β升高，但其与ISG抑制无相关性。鉴于GM-CSF在单核细胞-巨噬细胞分化中的已知作用，研究人员发现GM-CSF单独使用即可强烈抑制ISG表达，且共培养效应不超过GM-CSF单独效应。通过检测GM-CSF靶基因CISH表达、细胞上清ELISA定量以及下游STAT5磷酸化，证实GB细胞（LN229、T98G、U87）分泌GM-CSF，而U251不分泌。剂量效应实验显示，重组人GM-CSF低至50 pg/ml即可显著抑制ISG表达，达到与LN229共培养相当的效果，且该效应仍不出现于小胶质细胞。转录组分析进一步验证：重组GM-CSF处理、LN229共培养和U251共培养三种条件下，仅前两者出现CoR-ISGs的同步降低；GM-CSF中和抗体验证GM-CSF阻断可部分恢复ISG表达。

机制探索方面，研究人员排除了IFNAR的核心作用：共培养不影响IFNAR1的mRNA和表面蛋白表达，B18R（I型IFN诱饵受体）和IFNAR2中和抗体虽降低基础ISG水平，但共培养和GM-CSF介导的ISG下调仍然存在。GSEA分析指向TGF-β信号通路富集，"(Foroutan) integrated TGF-β EMT up"基因集在共培养单核细胞和GM-CSF分泌型GB细胞系中均显著富集。尽管TGF-β蛋白浓度在共培养中无变化，但GM-CSF中和可消除TGF-β签名富集。磷酸化SMAD2（pSMAD2）在共培养中升高，但重组GM-CSF处理仅轻微诱导，提示内源性与外源性GM-CSF活性差异。TGF-β（1 ng/ml）处理直接降低ISG表达，TGF-β抑制剂SB431542（10 μM）可部分逆转共培养中的ISG下调但对GM-CSF处理效应甚微，表明TGF-β参与但非唯一机制。

临床转化验证采用40例GB患者组织微阵列的多重荧光免疫组织化学（mfIHC）。结果显示：MO-TAMs占9.24%，多于MG-TAMs（1.97%），间充质性亚型中更明显；ISG15^hi细胞占8.94%，CISH^hi占18.84%，核pSMAD2^hi占40.41%；MG-TAMs中53.06%为高ISG15，而GB细胞和MO-TAMs仅6.49%和9.63%高表达。ISG15与CISH在空间上呈互斥分布，Manders'共定位系数极低（M1=0.29，M2=0.27）。MO-TAMs中ISG15^hiCISH^hi双阳性仅1.6%，而单阳性分别为6%和7.36%；MG-TAMs则无此偏向。空间距离分析显示，CISH^hi细胞与ISG15^lo MO-TAMs和GB细胞的距离显著近于ISG15^hi者，而MG-TAMs无此差异。功能上，ISG15^lo MO-TAMs占比与T细胞丰度负相关，T细胞与ISG15^hi MO-TAMs的距离显著近于ISG15<sup>lo我读入的数据被截断了，但我需要总结的是论文讨论部分和结论部分。由于用户提供的论文文本在"ISG15lo"处截断，我将基于已有信息完成解读。

讨论部分，研究人员首先讨论I型IFN在TME中的免疫刺激和肿瘤抑制作用，指出GB中单核细胞及其后代既是I型IFN的主要来源也是主要靶点。研究观察到GB系共培养特异性降低ISG表达，与其他肿瘤模型（肺癌、黑色素瘤）中ISG升高形成对比，这可能源于GB的高度异质性。与Klemm等报道的GB条件培养基中巨噬细胞ISG升高不同，本研究强调早期单核细胞-肿瘤细胞直接接触中可溶性因子的作用，且该效应为单核细胞特异性（小胶质细胞不受影電）。研究人员特别指出，尽管TAMs通常被认为是免疫抑制的，但共培养单核细胞显示出广泛的促炎转录组和分泌细胞因子谱，ISG耗竭是特异性特征。

关于GM-CSF的作用，研究人员注意到其双重性：既是髓系细胞生成、功能和存活的重要生长因子，可诱导单核细胞炎症表型；又在极低浓度（pg/ml级）强力抑制I型IFN应答基因表达。这拓展了早期关于GM-CSF极化巨噬细胞对病毒易感性增高、I型IFN和ISGs表达降低的报道，也与Kasper等发现GM-CSF降低STAT1、STAT2、JAK1和TYK2磷酸化的研究一致。本研究的独特之处在于发现病理生理浓度的GM-CSF即可全局性降低I型IFN应答，并通过中和实验建立与GB共培养的联系。

TGF-β信号的讨论强调其免疫抑制功能与I型IFN抑制的关联。虽然TGF-β降低I型IFN信号早有报道（肺泡巨噬细胞、自发性乳腺肿瘤模型），但本研究发现GB细胞系中TGF-β EMT签名富集不依赖TGF-β蛋白浓度变化，而GM-CSF中和可克服该签名，提示GM-CSF直接激活TGF-β信号。然而，重组GM-CSF对TGF-β信号效应微弱，且TGF-β抑制仅部分挽救共培养而非GM-CSF处理的ISG下调，暗示内源性与外源性GM-CSF的生物活性差异，具体机制待阐明。

研究人员还讨论了STAT1磷酸化降低但不涉及IFNAR的深层机制，指出SOCS蛋白家族、SHP1和SHP2磷酸酶等已知I型IFN信号抑制介质未被证明参与，需要进一步研究。

临床前验证方面，mfIHC数据支持了体外发现：MO-TAMs中ISG表达低于MG-TAMs，与既往报道GB相关小胶质细胞相对于稳态小胶质细胞I型IFN签名更高相呼应。GM-CSF靶基因CISH与ISGs空间分离，邻近CISHhi细胞的MO-TAMs呈ISGlo，而MG-TAMs无此现象，证实MO-TAMs特异性。间充质性亚型GB中ISG表达更低，与细胞系数据一致。研究人员推测GM-CSF和TGF-β作为早期介质，为导致ISG减少的下游调控奠定基础。

关于功能后果，研究人员提出ISG耗竭的MO-TAMs降低T细胞招募能力，类似联系在既往文献中已有描述。CXCL10作为IFN调控的重要T细胞趋化因子，可能是关联机制之一。研究人员假设IFN耗竭的MO-TAMs促进GB TME的免疫抑制调制，导致疾病预后不良。同时提及缺氧可上调单核细胞ISG表达，其在GB TME中的具体作用有待研究。

结论部分指出，研究人员表征了GB TME中肿瘤细胞与外周单核细胞早期相互作用时的I型IFN抑制通路，GM-CSF和TGF-β的鉴定为未来治疗策略开辟了新途径。</sup>