《Leukemia》：Linperlisib enhances MUC1-Tn CAR T cell efficacy by inhibiting EGR1/DUSP2 axis to prevent CAR T cell exhaustion
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嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中疗效欠佳，主要归因于肿瘤细胞与正常T细胞共享抗原表达导致的靶向介导的fratricide（同胞杀伤）以及效应T细胞耗竭。黏液蛋白1-Thomsen-nouvelle（MUC1-Tn）抗原
嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中疗效欠佳，主要归因于肿瘤细胞与正常T细胞共享抗原表达导致的靶向介导的fratricide（同胞杀伤）以及效应T细胞耗竭。黏液蛋白1-Thomsen-nouvelle（MUC1-Tn）抗原在包括T-ALL在内的多种恶性肿瘤中高表达。在本研究中，研究人员证实了MUC1-Tn蛋白在T-ALL细胞系和原代患者来源骨髓细胞中的表达，并随后开发了MUC1-Tn靶向CAR T细胞。这些CAR T细胞在体外细胞毒性实验和异种移植模型中有效裂解T-ALL细胞。鉴于PI3Kδ信号通路在调节T细胞功能和肿瘤免疫抑制中的关键作用，研究人员将MUC1-Tn CAR T细胞与PI3Kδ抑制剂linperlisib联合应用。Linperlisib增强了MUC1-Tn CAR T细胞的抗白血病疗效和持续存在能力，这与其降低T细胞耗竭标志物表达、减少终末分化细胞比例以及在再次攻击时维持肿瘤控制有关。此外，linperlisib诱导CAR T细胞发生线粒体融合并增强其呼吸能力。机制上，这种增强的持续存在能力归因于linperlisib介导的双特异性磷酸酶2（Dual Specificity Phosphatase 2, DUSP2）及其上游转录因子早期生长反应蛋白1（Early Growth Response 1, EGR1）的抑制。
T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）是一种源自T细胞祖细胞的高度侵袭性血液系统恶性肿瘤，约占急性淋巴细胞白血病（ALL）病例的10%–25%。相较于B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL），T-ALL患者通常预后更差、复发率更高且易出现耐药性，凸显了对新型治疗策略的迫切需求。嵌合抗原受体T（CAR T）疗法已彻底改变了复发/难治性（r/r）B-ALL的治疗格局，但其在T-ALL中的疗效仍然有限，主要原因在于：一是肿瘤特异性靶抗原的稀缺；二是效应细胞在治疗过程中的功能耗竭——这些因素均会损害疗效并增加不良事件风险。
现有泛T细胞靶点的局限性充分说明了T-ALL抗原稀缺的问题。CD7和CD5等靶点与B细胞恶性肿瘤中的CD19不同，它们在肿瘤和正常T细胞上均有表达。因此，靶向这些抗原的CAR T细胞无法区分恶性与正常T细胞，在扩增过程中发生fratricide（同胞杀伤），从而损害治疗疗效。为应对这一挑战，肿瘤相关碳水化合物抗原（TACAs）因其在肿瘤细胞中高表达而在正常组织中低表达或不表达的特点，成为潜在的治疗靶点。其中，黏蛋白MUC1（CD227）的异常糖基化模式尤为关键：在正常细胞中，O-糖基化始于N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）通过GalNAc转移酶（GalNAc-T）连接至MUC1的丝氨酸/苏氨酸残基，形成Tn抗原（CD175；GalNAcα1-O-Ser/Thr）。随后，核心1 β3-半乳糖基转移酶（core 1β3GalT，T-synthase）延伸添加半乳糖（Gal），形成T抗原（Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr），并可进一步延伸为更复杂的聚糖。然而，在肿瘤细胞中，核心-1 β1-3半乳糖基转移酶特异性伴侣1（COSMC）或T-synth酶的突变/沉默导致糖基化停滞，致使Tn抗原异常表达。Posey等人此前开发了靶向MUC1癌症相关Tn糖型CAR，对多种腺癌和骨髓来源恶性肿瘤有效。此外，Tn抗原在多种白血病细胞中的表达已得到验证，MUC1靶向免疫治疗在实体瘤中已建立临床前基础。在此基础上，本研究首先对T-ALL中的MUC1-Tn表达进行了表征，并随后开发了针对该靶点的特异性CAR。靶向肿瘤MUC1-Tn的CAR T疗法有望规避与泛T细胞抗原相关的fratricide问题，为T-ALL治疗提供新策略。
此外，持续的肿瘤抗原暴露驱动CAR T细胞过度活化，导致两个关键问题：一是上调抑制性受体如程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、T细胞免疫球蛋白黏蛋白域蛋白3（TIM-3）和淋巴细胞活化基因3（LAG-3），损害细胞毒功能——表现为穿孔素或颗粒酶B释放减少、白细胞介素-2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等细胞因子分泌降低；二是抑制干细胞样记忆T细胞（T
SCM）——这一关键的长效记忆T细胞亚群。这种向短命效应记忆T细胞（T
EM）或终末耗竭T细胞（T
TE）的异常分化严重损害了持久性。为应对这些挑战，研究人员探索了将CAR T细胞与免疫检查点抑制剂、BTK抑制剂或MEK抑制剂联合应用以延长其活性的组合策略。值得注意的是，PI3K抑制剂已被证明可通过表观遗传和代谢重编程促进干细胞样CAR T表型并增强持久性，其中PI3K-FOXO1轴在调节T细胞持久性中发挥关键作用。基于此理论框架，本研究采用具有良好临床安全性的选择性口服PI3Kδ抑制剂linperlisib，与MUC1-Tn CAR T细胞联合应用以增强其持久性。
本研究首先通过流式细胞术和蛋白质免疫印迹分析，在T-ALL细胞系（Jurkat E6.1、Hut-78、Molt4）、皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）细胞系（HH、Mac1）以及B-ALL细胞系（Nalm6、Reh）中检测MUC1-Tn（CD175）的表达情况。结果显示，除Reh细胞外，其余细胞系均表达Tn抗原，且T-ALL细胞系表达水平更高。为进一步验证临床相关性，研究人员采集了5例T-ALL患者及健康供者的骨髓样本，流式细胞术证实患者样本中Tn表达显著升高。基于这些发现，研究人员选择MUC1-Tn作为T-ALL CAR T细胞开发的靶点。
在靶点验证基础上，研究人员构建了MUC1-Tn CAR结构，其包含人源抗Tn单链可变片段（scFv）、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、4-1BB细胞内共刺激域和CD3ζ细胞内信号域，并克隆至pLVX慢病毒载体中，同时插入EGFP标签以便检测验证。经荧光显微镜和流式细胞术确认，慢病毒转导效率约为67.9%，蛋白质免疫印迹证实了MUC1-Tn scFv的表达。凋亡实验表明，MUC1-Tn CAR T细胞对两种T-ALL细胞系具有 potent 细胞毒性，对Jurkat E6.1细胞的杀伤效果与更高的Tn抗原表达水平相关。安全性评估显示，CAR T细胞对Tn阴性的Molt4 T-ALL细胞系无显著杀伤作用，对表达全长MUC1但缺乏Tn抗原的MCF-10A细胞亦无毒性；此外，与未转导T细胞共培养时未观察到fratricide现象，证实了MUC1-Tn CAR T细胞具有强效的特异性抗肿瘤活性和良好的安全性。
随后，研究人员评估了PI3Kδ抑制剂linperlisib对MUC1-Tn CAR T细胞抗白血病疗效的体外影响。Linp-CAR T细胞与T-ALL细胞系Jurkat E6.1和Hut-78共培养6小时后，流式细胞术分析肿瘤细胞凋亡，并通过脱颗粒标志物CD107a、细胞毒性颗粒释放（穿孔素/颗粒酶B）、细胞因子分泌（IL-2、IFN-γ、TNF-α）以及乳酸脱氢酶（LDH）释放实验评估效应功能。结果表明，与常规CAR T细胞相比，Linp-CAR T细胞表现出显著增强的剂量依赖性肿瘤杀伤能力，在各效应细胞与靶细胞比例（E:T ratio）下凋亡增加、靶细胞裂解增多；功能实验显示CD107a表达增强，颗粒酶B/穿孔素释放增多，细胞因子分泌升高。这些发现在5例MUC1-Tn
+ T-ALL患者的骨髓样本中得到验证：Linp-CAR T细胞相比未处理T细胞和传统CAR T细胞，展现出更优的肿瘤杀伤、裂解能力、脱颗粒、细胞毒性颗粒释放和细胞因子分泌。
为评估linperlisib对T细胞和CAR T细胞的安全性及其对效应细胞分化和耗竭的影响，研究人员首先检测了增殖、分化和耗竭标志物表达。结果显示，linperlisib处理的T细胞和CAR T细胞在各浓度下均保持与未处理对照组相当的增殖能力和活力。在1 μM浓度时，linperlisib显著增加CD8
+ T细胞比例（P ≤ 0.001），降低调节性T细胞（Treg）比例。剂量递增研究显示，初始T细胞（T
N）和中央记忆T细胞（T
CM）频率增加，效应记忆T细胞（T
EM）和终末耗竭T细胞（T
TE）减少，同时耗竭标志物（LAG-3、PD-1、TIM-3）呈进行性下调。经T-ALL细胞系刺激后，linperlisib处理的CAR T细胞与未处理对照相比，Treg比例更低、耗竭标志物表达更低、终末耗竭T细胞群体更少，表明linperlisib有效延缓T细胞和CAR T细胞耗竭并减少耗竭标志物表达，从而增强CAR T细胞介导的抗肿瘤效应的效力和持久性。
研究人员进一步探讨了linperlisib对CAR T细胞持久性的影响机制。透射电子显微镜显示linperlisib诱导线粒体融合，表现为线粒体体积增大、 elongated 网状结构形成及嵴结构完整。分子水平上，linperlisib上调融合介导分子MFN1/2和生物发生调节因子PGC1-α，同时降低裂变相关pDRP1活性。功能上，Seahorse分析证实处理细胞的基础呼吸和最大呼吸增加，反映代谢能力增强。这些发现表明linperlisib促进CAR T细胞线粒体融合和呼吸功能，可能有助于其改善的持久性。
为评估linperlisib处理CAR T细胞在体内的治疗效果，研究人员建立了Jurkat E6.1白血病异种移植模型。肿瘤接种7天后，B-NDG小鼠被随机分为四组：生理盐水（NS）组、未转导T细胞（UT）组、CAR T细胞组和linperlisib处理CAR T细胞（Linp-CAR T）组。通过生物发光成像监测白血病进展，结果显示CAR T和Linp-CAR T组均优于对照组，肿瘤负荷显著降低、生存期延长。值得注意的是，CAR T单药治疗在第21天后出现肿瘤控制减弱，而Linp-CAR T细胞实现了增强且更持续的肿瘤清除。机制上，Linp-CAR T细胞表现出更高比例的CD8
+和中央记忆亚群、更少的终末耗竭T细胞，以及下调的耗竭标志物（LAG-3/PD-1/TIM-3）。
在建立细胞系来源异种移植（CDX）模型疗效基础上，研究人员进一步在临床相关性更强的患者来源异种移植（PDX）模型中评估了linperlisib处理CAR T细胞。使用高MUC1-Tn表达的原代患者肿瘤细胞建立PDX模型，结果显示CAR T和Linp-CAR T均较对照显著延长生存期，两组均缓解了脾肿大，其中Linp-CAR T治疗效果更为显著。为评估CAR T细胞在体内的持久性，研究人员建立了肿瘤再次攻击模型：肿瘤移植后，小鼠经尾静脉接收CAR T或Linp-CAR T细胞（效应细胞与靶细胞比例为3:1）。两种治疗均在第10天诱导大量肿瘤缩减、第14天接近完全缓解；再次攻击后，对照CAR T治疗小鼠出现复发，而Linp-CAR T治疗小鼠维持持续缓解，生存期显著延长。流式细胞术显示，linperlisib处理 attenuated 了耗竭标志物的上调和T
TE比例的增加，无论是在再次攻击前还是攻击后。
为进一步探究linperlisib增强CAR T细胞功能持久性的分子机制，研究人员对肿瘤刺激后第15天的CAR T和Linp-CAR T细胞进行了RNA测序。分析鉴定出651个差异表达基因，其中关键耗竭和分化调控因子包括EGR1、EGR2、FOS、JUNB、TOX2和BATF3。基于转录谱分析，研究人员选择候选基因在蛋白水平进行验证。蛋白质免疫印迹证实linperlisib处理显著下调EGR1、EGR2和DUSP2，同时显著上调BATF3。为进一步阐明linperlisib缓解MUC1-Tn CAR T细胞耗竭的转录调控网络，研究人员使用Cytoscape构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析差异表达基因，鉴定DUSP2为枢纽基因。DUSP在T细胞活化、衰老、耗竭和稳态中发挥多效性作用，慢性活化导致DUSP过表达和T细胞耗竭。
为验证D验证DUSP2在MUC1-Tn CAR T细胞耗竭中的功能，研究人员进行了药理学和遗传学实验。使用不同浓度Salubrinal（尽管其经典作用为eIF2α去磷酸化抑制剂，但已知可在免疫细胞中下调DUSP2表达）处理第12天MUC1-Tn CAR T细胞24小时后，流式分析显示细胞表型从效应和终末耗竭状态向初始和记忆样状态转变，同时耗竭标志物进行性降低。为进一步佐证，研究人员使用慢病毒shRNA生成DUSP2敲低MUC1-Tn CAR T细胞，结果显示DUSP2敲低促进更有利的分化表型，中央记忆T细胞增加、终末分化效应T细胞减少、耗竭标志物显著降低。相反，DUSP2过表达产生相反效应，促进终末耗竭分化并上调耗竭标志物，确立DUSP2为MUC1-Tn CAR T细胞耗竭的重要调控因子。
为探索DUSP2的上游调控机制，蛋白质对接预测提示DUSP2与EGR1存在潜在相互作用。共免疫沉淀（Co-IP）证实EGR1特异性抗体可从细胞裂解液中下拉DUSP2，验证了两者的物理相互作用。为阐明其调控关系，药理学抑制实验显示DUSP2抑制剂降低DUSP2蛋白水平但不影响EGR1，而EGR1抑制则同时降低EGR1和DUSP2丰度，表明EGR1在该调控轴中位于DUSP2上游。
鉴于EGR1对DUSP2的转录调控以及PI3K-AKT信号对EGR1表达的调节作用，研究人员检测了其他PI3Kδ或PI3Kδ/γ抑制剂对这两种分子表达的影响。三种PI3K抑制剂（linperlisib、duvelisib、idelalisib）均降低AKT磷酸化，伴随EGR1和DUSP2表达下降。为进一步确立EGR1-DUSP2轴在调控CAR T细胞耗竭中的功能相关性，研究人员构建了三种功能不同的CAR T细胞模型（对照、单独EGR1抑制、DUSP2过表达联合EGR1抑制）。流式分析显示，单独EGR1抑制较对照显著减少终末耗竭细胞群体、降低耗竭标志物（LAG-3/PD-1/TIM-3）表达；值得注意的是，单独EGR1抑制的抗耗竭效果优于DUSP2过表达联合EGR1抑制，提示DUSP2可能通过EGR1依赖性和非依赖性机制共同促进耗竭。这些发现将EGR1-DUSP2信号轴确立为CAR T细胞耗竭的重要贡献通路，为linperlisib促进CAR T细胞持久性提供了机制见解。
在讨论部分，研究人员指出TACAs特别是MUC1-Tn抗原由于COSMC沉默或T-synthase突变诱导的糖基化阻滞，因其肿瘤特异性表达模式而成为有前景的替代靶点。除作为抗原靶点的价值外，MUC1蛋白在T-ALL发病机制中发挥双重作用：不仅呈递Tn抗原，还通过与T细胞上ICAM-1的相互作用作为免疫检查点分子，破坏免疫突触形成并损害T细胞效应功能。限制CAR T细胞疗效的关键挑战在于体内持久性不足，主要由持续抗原暴露驱动免疫检查点分子上调和促进T细胞耗竭，表现为细胞毒活性降低、增殖受损和凋亡。T细胞分化状态与代谢编程密切相关，决定输注后扩增和长期持久性。激活后，PI3K-AKT-mTOR通路驱动代谢从重氧化磷酸化（OXPHOS）向有氧糖酵解（Warburg效应）重编程；然而持续刺激过度激活该通路，诱导转录重编程上调耗竭标志物、下调记忆相关因子，最终导致终末分化和CAR T细胞持久性不佳。因此，在CAR T制造过程中调节该通路成为促进具有增强自我更新能力的记忆表型的策略。
在本研究中，研究人员开发的MUC1-Tn靶向CAR T细胞表现出对T-ALL potent 而特异性的细胞毒性，无脱靶效应或fratricide。这些细胞在CDX和PDX模型中有效清除肿瘤，显著延长生存期。功能上，linperlisib预处理增强CAR T脱颗粒、细胞因子释放和对Tn阳性靶标的细胞毒性；表型上，下调耗竭标志物（PD-1、TIM-3、LAG-3）、减少终末耗竭亚群和Treg浸润、促进线粒体融合和代谢适应性，共同促进功能持久性改善。再次攻击实验中验证了这种增强的持久性：linp-CAR T细胞在二次挑战时维持持续缓解，而对照CAR T细胞失败。值得注意的是，尽管CD28共刺激域与4-1BB在持久性方面存在差异（后者通常赋予更优持久性），linperlisib在CD28 CAR T制造过程中的处理同样延长了生存期，伴随耗竭标志物表达降低和终末分化细胞比例减少，表明观察到的增强作用独立于共刺激域。
为进一步鉴定核心调控因子，研究人员结合PPI网络分析和差异基因筛选，鉴定DUSP2为重要候选基因。这与先前研究一致，显示DUSP2在耗竭肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中上调，通过双重机制加剧T细胞功能障碍——抑制增殖能力并直接激活免疫检查点分子如PDCD1的转录。功能验证表明DUSP2敲低缓解CAR T细胞耗竭表型，而过表达则加剧耗竭，确认其在调控CAR T细胞耗竭中的重要角色。机制上，分子对接预测结合共免疫沉淀验证揭示DUSP2与EGR1的物理相互作用，EGR1在PI3K-AKT-EGR1-DUSP2信号轴中位于DUSP2上游。
除该轴外，转录组测序还揭示了与T细胞耗竭和记忆T细胞分化相关的其他基因表达变化。具体而言，linperlisib处理下调FOS和JUNB表达，同时上调BATF3，与FOS/JUNB促进耗竭相关基因转录、BATF3破坏BATF-IRF4-NFAT复合物以终止耗竭信号的经典调控网络一致。BATF3上调与近期发现BATF3过表达促进记忆T细胞编程并通过BIM介导的调控增强CAR T持久性相符。此外，研究人员观察到Linp-CAR T细胞中TOX1 mRNA降低而TOX2 mRNA和蛋白表达增加。TOX1是CD8
+ T细胞耗竭的 established 驱动因子，其下调与观察到的耗竭减少表型一致；相反，TOX2已被证明促进中央记忆T细胞分化，提示其上调可能有助于Linp-CAR T细胞中增强的记忆表型。这些转录组变化——包括FOS/JUNB、BATF3和TOX家族成员的调节——表明CAR T细胞耗竭的调控机制超越单一通路，多个因素可能与EGR1-DUSP2轴协同参与，形成多方面协调的调控网络。
研究人员也指出了本研究的局限性：原代T-ALL样本队列较小（n=5），限制了关于MUC1-Tn表达异质性和治疗反应的 结论；由于实际限制，未能在动物模型中对CAR T细胞表型进行连续监测；DUSP2的下游信号通路 未完全阐明。为提供未来临床前评估的基础，需要更大患者队列验证、协同基因组合探索（如BATF3或FOXO1调节）以及系统安全性评估等进一步研究。此外，可探索多种工程策略以减轻潜在的on-target/off-tumor毒性并增强抗肿瘤疗效，包括通过联合治疗上调MUC1-Tn表达、双靶点逻辑门控CAR的条件激活，以及纳入安全开关（如iCas9、HSV-TK）以精确控制CAR T细胞活性。
研究结论指出：研究人员验证了MUC1-Tn作为T-ALL治疗靶点，并证明linperlisib增强MUC1-Tn CAR T细胞的持久性和疗效，EGR1-DUSP2轴的抑制是其中的重要贡献机制。
