《Nature Aging》：Therapeutic targeting of the conserved region within the low-complexity domain of TDP-43 is neuroprotective and extends survival in amyotrophic lateral sclerosis mice
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摘要：TARDBP（编码TAR DNA结合蛋白43，TDP-43）的常染色体显性突变可导致肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS），且TDP-43病理改变是多种衰老相关神经退行性疾病的核心标志。尽管TDP-43的
摘要：TARDBP（编码TAR DNA结合蛋白43，TDP-43）的常染色体显性突变可导致肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS），且TDP-43病理改变是多种衰老相关神经退行性疾病的核心标志。尽管TDP-43的致病作用已被确认，但目前仍缺乏安全、强效且能靶向TDP-43神经毒性的分子药物。本研究表明，TDP-43低复杂度结构域（low-complexity domain, LCD）中跨越第320–340位氨基酸残基的保守α螺旋区域（conserved region, CR或conserved α-helical region 320–340）是可干预TDP-43神经毒性的治疗靶点。删除CR可显著抑制TDP-43诱导的神经元死亡。基于结构的虚拟筛选鉴定出可穿透血脑屏障的小分子化合物XL20，其结合CR并发挥神经保护作用，且不影响TDP-43的剪接（splicing）活性。XL20可减轻TDP-43 p.Ala315Thr ALS转基因小鼠的运动神经元丢失、延长生存期，并在携带p.Gln331Lys突变的人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源运动神经元中改善神经元功能。机制上，靶向CR可抑制TDP-43向线粒体的异位定位（mitochondrial localization）并通过液-液相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）恢复线粒体功能。上述发现提示CR是TDP-43相关神经退行性疾病的治疗靶点，支持CR结合小分子作为候选治疗药物进一步开发。
论文解读——《Nature Aging》发表研究：靶向TDP-43低复杂度结构域保守区(CR)抑制神经毒性并改善ALS小鼠表型
研究背景与立项依据
TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的细胞核 depletion伴胞质异常聚集是肌萎缩侧索硬化症（ALS）及额颞叶变性伴TDP-43病理（FTLD-TDP）的特征性改变，亦见于阿尔茨海默病（AD）等相关痴呆。绝大多数疾病相关TARDBP突变富集于C端甘氨酸富集的低复杂度结构域（low-complexity domain, LCD），该区域具有淀粉样倾向并能介导液-液相分离（liquid–liquid phase separation, LLPS）。然而LCD中介导TDP-43神经毒性的核心基序尚未明确，且尚无可穿透血脑屏障并选择性抑制TDP-43病理性毒性而保留其核内RNA调控功能的小分子药物进入临床。本研究旨在鉴定LCD中介导TDP-43神经毒性的保守区（conserved region, CR，残基320–340），并基于该靶点筛选及验证具有神经保护作用的先导小分子。
主要关键技术方法
研究人员采用：(1)原代小鼠皮质神经元及AAV1介导的脊髓内注射TDP-43野生型(WT)、ΔCR（缺失CR）、ΔNLS（核定位信号缺失致胞质定位）及ΔNLS/ΔCR突变体重组表达体系；(2)基于AlphaFold预测及PDB 8GCC结构的TDP-43 CR区分子对接虚拟筛选Asinex BioDesign化合物库（190,337个），经类药性与血脑屏障通透性初筛获得候选分子XL20–XL27，重点研究XL20；(3)表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）及细胞热位移实验（cellular thermal shift assay, CETSA）验证XL20与TDP-43 CR的直接结合及靶点参与（target engagement）；(4)TDP-43 p.Ala315Thr hemizygous转基因ALS小鼠及人iPSC来源p.Gln331Lys突变运动神经元进行体内外药效评价；(5)线粒体分离组分分析、耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）测定及活细胞成像分析TDP-43线粒体定位与LLPS动态关系；(6)突触体定量质谱与RNA测序评估CR遗传缺失或XL20处理的转录/蛋白谱影响。
研究结果
TDP-43 neurotoxicity depends on conserved region
在小鼠原代皮质神经元中过表达EGFP–TDP-43 WT或ΔNLS（胞质定位增强）诱导神经元死亡，而缺失CR（ΔCR或ΔNLS/ΔCR）显著抑制该死亡效应。在C57BL/6J小鼠腰髓鞘内注射AAV1-Syn-EGFP–TDP-43ΔNLS引起运动缺陷、脊髓运动神经元丢失、神经肌肉接头功能障碍及骨骼肌萎缩，而AAV1-ΔNLS/ΔCR组上述表型均被显著缓解。CR缺失不影响TDP-43ΔNLS的胞质定位及已知TDP-43靶基因剪接，但降低磷酸化及去垢剂不溶性TDP-43水平。表明CR是介导过表达TDP-43神经毒性的关键区域。
Identification of XL20 as a CR-binding small molecule suppressing TDP-43 neurotoxicity
对Asinex库进行基于CR区的结构虚拟筛选并结合细胞LLPS（液滴形成）及体外硫黄素T（Thioflavin T, ThT）聚集实验初筛，获得XL20–XL27，其中XL20在HEK293稳定株中剂量依赖性减少核内TDP-43凝聚体形成并抑制重组TDP-43 LCD聚集，且不干扰TDP-43依赖的ITPR3隐匿外显子剪接。在原代神经元中XL20（≥6.25 μM）显著挽救TDP-43 WT过表达引起的神经元死亡。SPR显示XL20与全长TDP-43结合（CR缺失或W334A突变消除此结合），CR多肽本身亦可结合XL20（弱微摩尔级）。细胞热位移实验证实XL20增加WT TDP-43热稳定性，而对TDP-43ΔCR或W334A无此效应。XL20的神经保护作用依赖于完整CR及Trp334。综上XL20是CR结合、选择性抑制CR依赖的LLPS/聚集并具有低微摩尔级神经保护活性的先导小分子。
Safety and pharmacokinetics of XL20 in mice
单次腹腔注射XL20 50、100、200 mg/kg，200 mg/kg组1/5死亡，50和100 mg/kg组无死亡、无明显血液学及主要脏器组织学异常。多次给药（50 mg/kg，每周3次，持续1月）耐受良好。药代动力学显示XL20（50 mg/kg）在血浆、脑脊液（CSF）、脑及脊髓迅速达峰（15–30 min），脑/血浆及脊髓/血浆浓度比＞0.5，具良好中枢穿透性；血浆t1/2≈3.81 h，脑t1/2≈0.85 h。杂合TDP-43ΔCR小鼠成年后行为正常，18月龄未见TDP-43聚集或神经元丢失，且小胶质细胞活化降低。XL20不影响Tau/Aβ聚集及FUS/hnRNPA1 LLPS。XL20在适宜剂量下安全性良好且具中枢渗透能力。
XL20 attenuates TDP-43 neurotoxicity in mice and human motor neurons
自45日龄始对TDP-43 p.Ala315Thr hemizygous小鼠给予XL20（50 mg/kg，i.p.，每3天1次），可消除悬尾试验后肢挛缩、改善转棒（rotarod）表现及步态异常，雄性小鼠生存期显著延长，雌性亦有延长趋势。终末点组织学显示XL20减轻脊髓运动神经元丢失、腓肠肌萎缩，减少胞质弥散性TDP-43异常定位及去垢剂不溶性（尤其C端剪切片段）TDP-43。在人iPSC来源p.Gln331Lys运动神经元中，20 μM XL20恢复树突棘密度、降低胞质TDP-43异常累积。表明XL20在ALS小鼠模型及人疾病来源运动神经元中具跨物种神经保护及表型改善作用。
Genetic deletion or pharmacological engagement of the CR enhances bioenergetics
年轻及老年TDP-43ΔCR小鼠突触体定量质谱显示差异表达蛋白富集于线粒体生物能学（氧化磷酸化、电子传递链复合体I/II/IV等）。TDP-43ΔCR HEK293细胞及XL20处理WT细胞基础与最大耗氧率升高（复合体I及I超复合物活性增强），分离自TDP-ΔCR小鼠脑线粒体呼吸及复合体I超复合物组装亦增强。原代神经元中WT或ΔNLS TDP-43破坏线粒体形态与膜电位（ΔNLS加重），CR缺失逆转之；p.Gln331Lys人运动神经元中XL20恢复线粒体长度与膜电位。在体AAV及p.Ala315Thr小鼠模型中CR缺失或XL20亦改善线粒体碎片化。提示CR调控下游线粒体生物能学。
Genetic deletion or pharmacological engagement of the CR suppresses mitochondria-associated TDP-43 likely via LLPS
亚细胞分馏显示TDP-43ΔNLS线粒体定位增强，CR缺失消除WT及ΔNLS TDP-43线粒体定位；XL20降低HEK293细胞及小鼠脑线粒体中内源性TDP-43含量。活细胞成像示TDP-43ΔNLS胞质凝聚体与线粒体呈瞬时"kiss-and-run"互作（平均接触约20 s），CR缺失、XL20处理或LLPS缺陷FYW-L突变均减少凝聚体形成及其线粒体关联。氧化或渗透压应激（NaAsO2、山梨醇）或线粒体解偶联剂（CCCP）、复合体III抑制剂（antimycin A, AMA）增强TDP-43凝聚体–线粒体静态结合及线粒体TDP-43水平。CR通过调控LLPS影响TDP-43线粒体异位定位，进而干预线粒体功能。
讨论与结论翻译
TDP-43参与多种主要神经退行性疾病中的神经元丢失。本研究揭示TDP-43 C端保守区（CR，残基320–340）在介导其神经毒性中的关键作用，确立该结构域为可成药靶点，并鉴定出与其结合的小分子XL20可在疾病模型中显著减轻TDP-43诱导的神经毒性。鉴于CR构象动态性，研究人员将XL20结合解释为与CR局部构象系综的相互作用而非刚性单一位点结合。遗传缺失CR或XL20药理干预均在不引起广泛蛋白聚集、核耗竭或所检测数种TDP-43 RNA靶标剪接改变的条件下发挥神经保护，提示毒性可在无典型核功能丧失时发生。CR的部分扰动可被耐受且不影响所检生理功能，治疗策略应偏向部分调节而非完全破坏CR功能。XL20具CR依赖性靶点参与、不干扰核心RNA调控功能、体内安全性良好、可穿透血脑屏障并在ALS小鼠及人突变运动神经元中具稳健功能性疗效。CR缺失或XL20处理抑制TDP-43线粒体定位（可能经LLPS介导），恢复线粒体呼吸尤其是复合体I及其超复合物活性——已知在ALS及AD等中受损。综上，靶向TDP-43 CR这一介导神经毒性但非必需全功能破坏的结构域，可有效抑制TDP-43相关神经退行，XL20为代表此类CR结合小分子提供有力概念验证，为TDP-43蛋白病治疗提供新方向。
