《Methods》：An accessible, absorbance-based plate reader assay to assess cumulative exposure of blood plasma & serum to thawed conditions
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Nilojan Jehanathan|Ishmael A. Quansah|Schuyler Kremer|Erandi P. Kapuruge|Chad R. Borges美国亚利桑那州坦佩市亚利桑那州立大学分子科学学院，邮编85287摘要人类血浆和血清的完整性对于可靠地发现和
Nilojan Jehanathan|Ishmael A. Quansah|Schuyler Kremer|Erandi P. Kapuruge|Chad R. Borges
美国亚利桑那州坦佩市亚利桑那州立大学分子科学学院，邮编85287
摘要
人类血浆和血清的完整性对于可靠地发现和验证生物标志物至关重要，但它们会因分析前暴露在解冻环境中（温度＞-30℃）而受到影响。目前用于评估血浆或血清完整性的质量控制方法数量有限，且往往需要如质谱法这类资源密集型技术。我们开发并验证了一种基于吸光度的板读仪检测方法，该方法利用白蛋白在体外对大多数小分子硫醇和二硫化物的氧化作用。该检测方法首先将硫醇和二硫化物与蛋白质分离，然后使用三(2-羧乙基)膦将其还原，接着用4-叠氮苯甲酸进行淬灭，最后让硫醇与埃尔曼试剂发生反应。该方法经过优化以提高检测效率，包括去除微量金属和减少硫醇再氧化的步骤。由于个体间基质效应的存在，为准确判断样本是否曾暴露在解冻环境中，需在样本有意使其达到失效状态前后分别进行检测，从而得到一个Δ吸光度值，该值可换算为Δ硫醇和二硫化物含量。该检测方法在多种不同个体基质中均表现出良好的线性、精密度和准确性。在23℃、4℃和-20℃下的稳定性测试显示，硫醇和二硫化物含量呈一致的指数衰减趋势，这与现有的基于LC/MS的ΔS-半胱氨酸-白蛋白检测方法观察到的结果相似。针对血浆和血清设定的参考范围足够宽，可用于分析来源不明的单个样本。这一潜力已通过盲测得到验证。该检测方法为量化血浆和血清的解冻暴露情况提供了一种实用且易于操作的工具，有助于从事临床或研究工作的研究人员更好地控制样本质量。
引言
人类生物样本的质量对于开展可靠、可重复的研究至关重要，尤其是在生物标志物的发现与验证这类关键领域[1]、[2]、[3]、[4]。从样本采集到储存的所有分析前流程被公认为是检测流程中最易出问题的环节，也是导致诊断错误的主要原因之一[1]、[5]、[6]、[7]、[8]。即便在这一阶段处理过程中出现细微差异，也可能会显著改变样本的分子组成，使其不再反映体内的真实情况。这就会引入偏差，进而影响后续分析所得数据的完整性和实用性[1]、[3]、[6]、[9]、[10]、[11]、[12]。正如我们之前所阐述的，采用“组学”方式开展研究的课题尤其容易受到这一问题带来的虚假发现陷阱的影响[6]。因此，迫切需要可靠的质控工具来实际评估生物样本的完整性[2]、[6]、[13]、[14]。
影响样本完整性的最重要的分析前因素之一就是样本暴露在解冻环境中（温度高于-30℃[15]、[16]）[1]、[2]、[6]、[14]、[17]。这种暴露可能是在样本采集、处理、运输过程中无意中发生的，也可能是由于冷冻柜故障等意外事件导致的[1]、[2]、[14]。虽然标准操作程序和详细的记录对于记录样本处理过程十分重要[14]、[18]，但它们往往无法全面记录所有相关事件，也无法精确量化单个样本或分装样本所受到的分子损伤[2]、[14]、[17]。这一局限性凸显出需要客观、定量的生物分析方法来验证生物样本的完整性，尤其是那些已被存档的样本[2]、[14]。
最近开发的ΔS-半胱氨酸-白蛋白检测方法在这一领域取得了重大进展。这是一种基于LC/MS的技术，可用于量化人类血浆和血清样本因暴露在解冻环境中所受的累积影响[2]、[6]、[14]、[17]、[19]。该检测方法基于血浆中最丰富的蛋白质——人血清白蛋白的体外氧化反应[20]。具体而言，它能够检测白蛋白中S-半胱氨酸化（氧化型）蛋白形式的相对含量增加情况，而这种情况会在血浆和血清样本被置于高于其冰点-30℃的环境中处理或储存时出现[2]、[6]、[14]、[17]。人血清白蛋白含有一个游离半胱氨酸残基（Cys34），该残基极易与游离半胱氨酸发生自发性的二硫键交换，这一过程会受到大气中的氧气以及铜等微量催化金属的影响[2]、[21]。目前已经确定了形成S-半胱氨酸-白蛋白的多反应速率定律，这使得可以大致反推未知血浆和血清样本在室温条件下的暴露时间[2]。ΔS-半胱氨酸-白蛋白方法的实用性已在盲测和实际应用场景中得到证实，它能够成功检测出未被发现的冷冻柜故障，而且还能与其他具有临床意义的蛋白质的稳定性变化相关联[2]、[6]、[14]、[17]。
尽管基于LC-MS的ΔS-半胱氨酸-白蛋白检测方法能为生物样本的完整性提供有价值的见解，但由于它依赖于质谱技术，因此在大规模生物库样本的高通量筛查中会耗费大量资源。目前仍亟需更简单、更易获取且成本更低廉的定量质控工具，以便在各种临床和研究环境中常规使用。本文正是为填补这一空白而开发的，我们设计并优化了一种基于吸光度的板读仪检测方法，用于测定血液血浆和血清样本的解冻暴露情况。该检测方法的生物分子原理及操作流程如图1所示。
硫醇-二硫化物平衡是细胞和血浆中生物氧化还原调节的基本机制[22]、[23]、[24]、[25]。传统的硫醇定量方法通常会使用埃尔曼试剂（5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，DTNB）这类试剂，它可与硫醇反应生成可测量的有色加合物[26]、[27]。然而，在复杂的生物样本中准确测定总硫醇和二硫化物含量，需要精心准备样本，包括降低二硫化物的浓度，并严格防止其再次氧化[23]、[28]、[29]、[30]、[31]。
该检测方法使用了三(2-羧乙基)膦作为高效的二硫化物还原剂[32]，同时还加入了4-叠氮苯甲酸作为淬灭剂[33]、[34]，随后通过精心设计的后续处理步骤，有效降低了新生成的硫醇的再氧化概率，避免了人工背景信号的干扰。通过优化以获得最大的吸光度信号，并进行后续的分析验证，该检测方法为实际评估血浆和血清的完整性提供了一种更便捷、更高通量且更具成本效益的手段。
章节节选
材料与试剂
人血清白蛋白（A1653）、马来酰亚胺（129585）、醋酸铵（A7330）、三氟乙酸（TFA，299537）、磷酸二氢钠（S8282）、氧化型L-谷胱甘肽（G6654）、乙二胺四乙酸二钾盐二水合物（03659）、L-半胱氨酸（C7352）、磷酸氢二钠（S7907）、DTNB（埃尔曼试剂；D218200）、还原型L-谷胱甘肽（G4251）、γ-谷氨酰-L-半胱氨酸（G0903）、盐酸（50–878-166）、HEPES（H3375）、氯化钠（S7653）、半胱氨酰甘氨酸
结果
除非另有说明，本文中提到的“失效”指的是将血浆和血清样本置于37℃的温箱中培养24小时，使其吸光度/Δ硫醇和二硫化物含量降至最低值。
讨论
那些在体外容易发生分子结构变化的分子，能否作为生物样本解冻暴露的内源标志物，其适用性在很大程度上取决于这些标志物在新鲜样本和完全失效样本中的浓度范围。正如我们在之前开发和验证ΔS-半胱氨酸-白蛋白方法时的研究所示，失效样本中的这些标志物浓度在不同个体之间并非恒定不变[2]、[6]。当其浓度不固定时，
结论
我们在此介绍了一种基于吸光度的板读仪检测方法，它的原理与我们之前开发的基于LC/MS的ΔS-半胱氨酸-白蛋白检测方法相同。由于无需使用LC/MS技术，且所需样本体积仅为50μL，因此该方法很容易被大多数生物医学研究团队采用。
利益冲突声明
作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究部分得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所的资助，资助编号为R21CA269091。本文内容完全由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
