SARS-CoV-2感染小鼠肺组织的时间进程蛋白质组学表征

《Molecular & Cellular Proteomics》：Temporal proteomic characterization of SARS-CoV-2 infected mouse lungs

　　

理解新冠病毒感染后肺组织中病理生理过程的动态激活对于有效治疗至关重要。已有研究对感染肺组织进行了时间进程转录组分析，但由于蛋白质才是病理生理过程的实际执行者，转录组数据对时间转换提供的信息有限。本研究对SARS-CoV-2感染的K18-hACE2转基因小鼠在感染后第0、1、2、5和7天取肺组织，采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行时间进程蛋白质组分析。通过聚类分析鉴定早期、中期和晚期上调蛋白，分析这些蛋白富集的通路，并对早、中、晚期上调通路进行网络分析，揭示了感染扰动下分子网络的详细动态激活；进一步提出5个标志物代表早-中期无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated decay, NMD；Smg6和Upf1)、中-晚期吞噬作用(phagocytosis；Fcgr4和Lamp2)及晚期中性粒细胞胞外诱捕网形成(neutrophil extracellular trap formation, NETosis；Padi4)的激活，这些可能与重症病理转变相关。免疫组织化学分析证实了时间进程蛋白质组数据所识别的5个标志物的时序上调模式，免疫荧光分析进一步确认Padi4在晚期主要于中性粒细胞中上调。本时间进程蛋白质组分析提示潜在的通路和分子标志物可用于预测SARS-CoV-2感染过程中向重症病理的转变。

论文解读：SARS-CoV-2感染小鼠肺组织的时间进程蛋白质组学表征及其在重症病理转变中的意义

一、研究背景与立题依据

新冠病毒感染过程中肺组织内多种病理生理过程呈动态激活，其时序转换常与疾病严重程度及预后密切相关。既往已有对SARS-CoV-2感染肺组织的时间进程转录组研究，也有基于COVID-19患者尸检肺组织的静态转录组和蛋白质组研究，但这些研究或仅反映基因表达层面变化（转录本与蛋白丰度存在解耦），或仅为感染后某一时间点的"快照"，缺乏感染进程中分子网络扰动的时序转换信息。迄今尚无SARS-CoV-2感染肺组织的时间进程蛋白质组学分析报道。为阐明感染过程中肺组织关键细胞通路的真实时序激活及代表各阶段转换的分子标志物，研究人员开展了此项K18-hACE2转基因小鼠肺组织感染后第0、1、2、5、7天的时间进程蛋白质组学研究。

二、主要关键技术方法

研究人员选用12周龄雄性K18-hACE2转基因小鼠（C57BL/6J背景），经鼻接种1×10⁶PFU SARS-CoV-2（NCCP43326株），于感染后第0、1、2、5、7天采集肺组织（n=5-6，第7天n=2）。采用4% SDS裂解、丙酮沉淀及滤膜辅助样品制备（Filter-Aided Sample Preparation, FASP）酶解获得肽段，分三组进行10-plex串联质量标签（Tandem Mass Tag, TMT）标记，每组含共用混合池质控样本以消除批次效应。标记肽段经高pH反相分级分离后，使用Q Exactive质谱仪进行数据依赖采集（Data-Dependent Acquisition, DDA）LC-MS/MS分析。原始数据用Proteome Discoverer结合SEQUEST HT检索小鼠UniProt数据库（FDR<1%），TMT报告离子定量后经分位数归一化及自标度化预处理。对8277个在三组TMT中均检出的蛋白计算各时间点相对于第0天的t值，应用正交非负矩阵分解（Orthogonal Non-negative Matrix Factorization, ONMF）聚类识别早、中、晚期上调蛋白群组，进行基于经验超几何检验的功能富集分析及KEGG互作网络构建。部分关键标志物（Smg6、Upf1、Fcgr4、Lamp2、Padi4）经免疫组织化学（Immunohistochemistry, IHC）及免疫荧光（Immunofluorescence, IF）验证细胞定位与表达时序。

三、研究结果

Comprehensive Proteome Landscape of SARS-CoV-2 Infected Mouse Lungs（SARS-CoV-2感染小鼠肺组织的全面蛋白质组学图谱）

LC-MS/MS共鉴定到10844个蛋白组（FDR<1%，至少1条独特肽段），其中8277个在三个TMT组中均被检出。与已发表的人COVID-19肺组织及仓鼠感染肺组织蛋白质组比较，本研究数据集覆盖率达75.6%–82.9%，且独有2168个蛋白编码基因，具较高全面性。功能富集显示检出蛋白显著代表细胞死亡、固有免疫应答、病毒生命周期、补体与凝血级联、吞噬作用、细胞因子应答及抗原加工提呈（Antigen Processing and Presentation）等GO生物过程（GOBP）及通路。基于此构建了固有免疫应答、抗原加工提呈及补体/凝血级联三类互作网络模型，证实数据集可全面覆盖SARS-CoV-2感染相关关键过程。

Temporal Transitions of Cellular Networks Activated along SARS-CoV-2 Infection（SARS-CoV-2感染过程中激活的细胞网络的时序转换）

ONMF聚类将8277个蛋白分为早（G1-3，第1-2天上调）、中（G4-6，第1或2天起持续上调）、晚（G7-9，第5或第5-7天上调）共9个上调群组。已知过程验证显示：固有免疫应答相关蛋白多从第1天上调，抗原加工提呈相关蛋白多从第2天上调，补体/凝血成分呈第2天与第5/7天混合上调模式，与文献报道相符。将早、中、晚期上调蛋白映射至前述网络发现：ND10复合体及Irf7信号相关蛋白属早期上调（绿色节点），其余固有免疫通路多属中期上调（蓝色节点）；补体C3b受体、缓激肽原及纤维蛋白溶酶途径组分等多属晚期上调（品红节点）。与人COVID-19尸检肺组织差异表达上调蛋白显著重叠于G4-9（中-晚期群组），支持时序分组的可靠性。

Cellular Processes Associated with Pathological Transitions（与病理转变相关的细胞过程）

对各群组做功能富集并计算Z分数评估早/中/晚期通路激活强度。无义介导的mRNA降解（Nonsense-Mediated Decay, NMD）、I型干扰素刺激基因（IFN-Stimulated Genes, ISGs）抗病毒机制及淋巴细胞介导免疫从早期延续至中期，其中NMD以早期Smg6及中期Upf1为核心因子，提示NMD参与早-中期病理过渡。吞噬作用（Phagocytosis）、溶酶体及伤口愈合相关通路从中期延续至晚期，Fcγ受体介导吞噬（Fc gamma receptor-mediated phagocytosis）及相关吞噬体成熟（Phagosome Maturation）因子（如Fcgr4中期上调、Lamp2晚期上调）提示其参与中-晚期过渡。NETosis（Neutrophil Extracellular Trap Formation，中性粒细胞胞外诱捕网形成）、补体激活及mTOR信号于晚期显著激活，NETosis关键染色质去致密酶Padi4（Peptidylarginine Deiminase 4）及NADPH氧化酶组分为晚期上调，表明NETosis启动于中期、表现于晚期。上述NMD、吞噬、NETosis三大通路在人COVID-19尸检肺组织差异表达蛋白及重症患者血清蛋白质组中亦显著富集。

NMD, Phagocytosis, and NETosis as Indicators of Pathological Transitions（NMD、吞噬作用和NETosis作为病理转变的指示物）

与同期已发表的小鼠肺组织时间进程RNA-seq数据进行ONMF比对，发现部分早、中期蛋白-转录本共享上调模式，而NMD相关蛋白（早期Smg6、中期Upf1）对应mRNA呈下调，体现转录-翻译水平差异调控。IHC定量显示：Smg6于第2天即明显升高（早期），Upf1于第2天较第0天显著升高（中期）；Fcgr4和Lamp2从第2天渐升（中-晚期）；Padi4于第7天显著升高（晚期），与蛋白质组聚类结果一致。IF双标显示Padi4与中性粒细胞标志物Ly6G/6C在第7天强烈共定位，证实NETosis晚期主要由浸润中性粒细胞执行。由此确定五标志物组合——Smg6与Upf1代表NMD（早-中期过渡）、Fcgr4与Lamp2代表吞噬/吞噬体成熟（中-晚期过渡）、Padi4代表NETosis（晚期重症过渡）。

四、讨论与结论总结（翻译浓缩）

本研究提供了SARS-CoV-2感染肺组织的时间进程蛋白质组谱，通过整合早/中/晚期上调蛋白群组、功能富集及通路网络分析，鉴定出NMD、吞噬作用和NETosis分别代表早-中、中-晚及晚期病理转变的关键通路。与已发表时间进程转录组比较显示吞噬与NETosis在mRNA水平亦有相应中、晚期激活；与人COVID-19尸检肺组织及患者血清蛋白质组比较显示三大通路在重症病例中显著上调，支持其与疾病严重度的关联。网络模型提出Smg6和Upf1（NMD）、Fcgr4和Lamp2（吞噬/吞噬体成熟）及Padi4（NETosis）可作为预测SARS-CoV-2感染过程中向重症病理转变的生物标志物，并经IHC/IF验证时序表达模式。NMD早期激活旨在抑制病毒复制，SARS-CoV-2 N蛋白可抑制NMD，导致其中期再激活反映初始抗病毒监视失败及炎症加剧；FcγR介导吞噬促进抗原提呈但亦可放大炎性细胞因子释放；过度NETosis致微血管血栓及组织损伤。本时间进程蛋白质组学资源揭示了感染进程中细胞通路的动态激活，提出的通路及分子标志物可为SARS-CoV-2感染重症化预测提供参考依据。数据已存入ProteomeXchange（编号PXD036193）。