利用库鲁病保护性G127V朊病毒蛋白变体的显性负效应作为新型朊病毒病治疗策略

《Neurobiology of Disease》：Leveraging the dominant-negative effect of the kuru-protective G127V prion protein variant as a novel therapeutic strategy

　　

摘要：朊病毒病是致死性神经退行性疾病，目前尚无获批疗法可阻止或逆转疾病进展。鉴于细胞型朊病毒蛋白（cellular prion protein，PrPC）的表达是朊病毒复制和神经毒性的必要条件，降低其表达是一种有前景的治疗策略。然而，完全敲除PrP（PrPC消融），如在未人为上调相邻Doppel基因的敲除模型中所示，会导致轻微的发育和行为异常，使得长期降低人PrPC表达的安全性尚不完全明确。本研究探讨了一种互补策略，即利用巴布亚新几内亚库鲁病抗性个体中天然存在的保护性G127V PrP变体的显性负（dominant-negative）效应。研究人员在CAD5细胞系中发现，诱导表达G126V PrP（小鼠同源物，对应人G127V）连同野生型（wild-type，WT）PrP，可剂量依赖性地预防和抑制朊病毒感染。将该研究拓展至表达草原田鼠（bank vole）PrP的CAD5细胞后，研究人员进一步证实G127V的保护效应跨越多种天然及人工来源的朊病毒毒株，凸显了该显性负策略的普适性。研究人员还证明该显性负效应可在小脑星形胶质细胞原代培养物中重现。值得注意的是，即便在G126V表达终止后，朊病毒抗性仍持续存在，表明具有持续性保护效应，可能免除治疗情境下持续转基因表达的需求。最后，研究人员发现无锚定（anchorless）、重组G127V PrP仍保有强效显性负活性，提示该蛋白可作为生物制剂（biological therapeutic）使用。综上，这些发现为将经自然选择具有保护作用的G127V PrP变体开发为治疗或预防朊病毒病的制剂奠定了框架。

论文解读：利用库鲁病保护性G127V朊病毒蛋白变体的显性负效应作为新型朊病毒病治疗策略

朊病毒病（prion diseases）是由细胞型朊病毒蛋白（cellular prion protein，PrP^C）错误折叠为具有感染性的朊病毒型（scrapie prion protein，PrP^Sc），并在脑内蓄积导致神经元功能障碍与死亡的致死性神经退行性疾病，目前尚无获批疗法可阻断或逆转病程。主流治疗策略包括抑制PrP^C向PrP^Sc转化、利用反义寡核苷酸或小干扰RNA降低PrP^C合成、促进PrP^Sc清除，但均受限于中枢神经系统的药物递送难题。其中降低PrP^C表达的策略虽在动物模型中有效，但完全敲除PrP基因（Prnp^?/?）在不伴随Doppel基因上调的小鼠中会出现细微发育、行为异常及外周神经病变，故长期安全性在人类中尚未明确。巴布亚新几内亚Fore族人群中存在PRNP基因G127V多态性，纯合子个体对地方性库鲁（kuru）朊病毒病完全抵抗，且G127V PrP因结构被锁定为转化无能构象，可与共表达的WT PrP产生显性负（dominant-negative）抑制效应。该研究由Boston University Chobanian & Avedisian医学院David A. Harris等团队合作完成，旨在细胞水平验证G127V/G126V PrP变体对多种朊病毒毒株感染与传播的抑制能力、量效关系、持续性及无膜锚定型重组蛋白的外源保护活性，为将其开发为朊病毒病治疗制剂提供依据。该论文发表于《Neurobiology of Disease》。

主要关键技术方法：采用CAD5小鼠 catecholaminergic细胞系及其Prnp^?/?敲除株、原代小鼠小脑接触抑制星形胶质细胞为模型；构建组成型及强力霉素（doxycycline，Dox）诱导的慢病毒/质粒表达系统用于小鼠G126V PrP与草原田鼠（bank vole）G127V PrP共表达，并以IRES2-eGFP报告荧光定量变体蛋白表达水平；使用小鼠适应毒株RML、22L、ME7，仓鼠毒株263K/139H/HY/DY，慢性消耗病（Chronic Wasting Disease，CWD）鹿与麋鹿细胞裂解物，以及Protein Misfolding Shaking Amplification（PMSA）体外合成的重组小鼠PrP^Sc（stML-01-Dx、btML-89-Dx、btML-90-Dx）进行感染；通过蛋白激酶K（proteinase K，PK）消化—免疫印迹检测PK抗性PrP^Sc，免疫荧光观察PrP^Sc聚集体，磷脂酶C（phosphatidylinositol-specific phospholipase C，PIPLC）释放实验确认细胞膜定位；大肠杆菌表达并纯化无糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定的重组野生型与G127V草原田鼠PrP（residues 23–230，I109），以实时震动诱导转化（Real-Time Quaking-Induced Conversion，RT-QuIC）评估转化能力，外源施加重组蛋白处理感染细胞后用MTT法检测细胞活力。

研究结果如下：

3.1 G126V PrP抑制培养细胞的朊病毒感染

研究人员将组成型过表达G126V PrP或WT PrP的CAD5细胞暴露于RML与22L感染性脑匀浆，连续传代后检测PK抗性PrP^Sc。结果显示未转染及WT PrP过表达细胞均建立慢性感染并产生高水平PrP^Sc，而G126V PrP共表达细胞PrP^{Sc显著减少，表明G126V PrP与WT PrP共表达可显著阻碍慢性朊病毒复制的建立。}

3.2 G126V PrP清除已慢性感染细胞中的PrP^Sc

研究人员向已慢性感染RML、22L、ME7的CAD5细胞转染G126V或WT PrP表达载体并传代。WT PrP过表达对PrP^Sc水平无影响，而G126V PrP过表达使22L感染的PrP^Sc大幅降低，对RML与ME7感染的PrP^Sc几乎完全清除，表明G126V PrP不仅能预防初始感染，对已建立的慢性感染亦具清除或强烈抑制作用。

3.3 调控G126V PrP表达的多西环素诱导系统

为排除抗体无法区分内源性WT与变体PrP的问题，研究人员构建Tet-On 3G诱导双顺反子慢病毒载体共表达G126V PrP与eGFP（IRES2连接），证实eGFP荧光与G126V PrP蛋白水平呈线性相关（R²=0.946），可通过Dox浓度精确调控变体表达量，为后续量效研究提供工具。

3.4 G126V PrP以剂量依赖性方式抑制初始朊病毒感染

用0、1、2 μg/mL Dox预诱导G126V PrP表达后感染22L毒株并连续传代。未诱导组PrP^Sc随传代累积，1 μg/mL与2 μg/mL Dox诱导组PrP^Sc积累受抑且2 μg/mL抑制更强，证实G126V PrP对初始感染的防护呈剂量依赖性。

3.5 G126V PrP以剂量依赖性方式降低慢性朊病毒感染

先将细胞在无Dox条件下建立22L慢性感染，再给予不同浓度Dox诱导G126V PrP表达并继续传代。结果显示G126V PrP同样以剂量依赖方式抑制已存在慢性感染中的PrP^Sc水平，与预防效果趋势一致。

3.6 G127V PrP对抗广谱朊病毒毒株

在CAD5.Prnp^?/?细胞中表达草原田鼠WT或G127V PrP（单独或共表达），分别用小鼠（RML、ME7、22L）、仓鼠（263K、139H、HY、DY）、CWD鹿/麋鹿及三种PMSA合成重组小鼠PrP^Sc感染。G127V单独表达细胞对所有毒株均不形成PrP^Sc，WT+G127V共表达细胞中各毒株PrP^Sc较WT+WT共表达细胞显著降低（降幅约30%–80%，依毒株而异），表明G127V PrP的抑制效应跨越物种与天然/合成毒株，具有广泛适用性。

3.7 关闭G126V PrP表达后朊病毒增殖抑制仍持续

用Dox诱导G126V PrP表达并感染22L，传数代后撤除Dox关闭变体表达继续传代，同时监测eGFP与总PrP确认系统关闭。结果发现PrP^Sc水平未回升至从未诱导组水平，且二次高浓度攻毒亦不能恢复PrP^Sc积累，提示短暂表达G126V PrP可产生持续性抑制效应，可能与PrP^Sc纤维结构改变或细胞降解途径长期激活有关。

3.8 重组G127V PrP降低慢性感染细胞PrP^Sc

研究人员从大肠杆菌表达纯化无GPI锚的重组草原田鼠WT与G127V PrP（aa 23–230，I109），RT-QuIC证实G127V不易被22L PrP^Sc种子转化。将该重组蛋白外源施加于22L感染的草原田鼠PrP表达CAD5细胞3天，重组G127V PrP剂量依赖降低PrP^Sc（IC₅₀≈0.3012 μM，最大抑制~50%），而重组WT PrP无影响，且两者均无细胞毒性，提示无膜锚定型G127V PrP具胞外显性负活性，可作生物治疗候选分子。

3.9 G126V预防静止期星形胶质细胞的朊病毒感染

对接触抑制达汇合的原代小鼠小脑星形胶质细胞慢病毒转导G126V或WT PrP后感染22L，21天后检测PK抗性PrP^Sc。G126V PrP表达使PrP^Sc水平较WT PrP对照组降低约30%，表明G126V PrP对分裂停滞的终末分化脑细胞同样具抗感染保护作用。

讨论与结论翻译：研究人员利用细胞感染模型探究天然库鲁保护性PRNP变体G127V作为朊病毒病替代治疗策略的可行性。研究证明共表达携带G127V置换或其小鼠同源G126V的PrP对多种生物学来源及合成朊病毒毒株的初始感染与后续传播具剂量依赖性显性负抑制效应。令人意外的是该抑制效应在G126V PrP合成终止后仍持续，对治疗应用具重要启示。此外无锚定重组G127V PrP外源施加亦可降低PrP^Sc增殖，支持其作为生物治疗制剂的开发潜力。结构学证据表明G127V置残基127甘氨酸为缬氨酸将PrP锁定于转化无能的PrP^C样构象，可能通过掺入PrP^Sc纤维生长端起"封端（end-capping）"作用或致不稳定纤维易清除而产生显性负效应。与完全敲除PrP^C相比，利用天然保护性变体抑制PrP^Sc形成避免了PrP^C缺失相关潜在风险。综上，G127V PrP——一种经自然选择具保护作用的PRNP多态性产物——在细胞环境中与WT PrP共表达或以可溶性重组蛋白形式外源给药，均可有效抑制朊病毒感染与PrP^Sc积累，为开发针对人类朊病毒病（包括变异型Creutzfeldt-Jakob病等）的新型治疗手段奠定机制与实验基础。